پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله زندگی جوامع امروزی مدتهاست که تحت تاثیر پیشرفت ها در تکنولوژی و صنعت قرار گرفته است. پیدایش نفت و پس از آن جداسازی مشتقات نفتی به سرعت سهم عمده ای از پیشرفت و رفاه اجتماعی را به دنبال داشته است. در دو دهه اخیر توجه بیشتری در خصوص تجزیه زیستی آلاینده های نفتی صورت گرفته است مبارزه با آلودگی های نفتی از زمان پیدایش این ماده سیاهرنگ اما گرانبها، بخشی از پژوهش های علمی را به خود اختصاص داده که در گذشته به مراتب کمتر و امروزه به طور روز افزون، توجه متخصصان و کارشناسان را به خود جلب کرده است این ترکیبات شامل شانزده آلاینده حلقوی تراتوژن و موتاژن موجود در مشتقات نفتی می باشند. پایرن و فنانترن از مهمترین و فراوان ترین ترکیبات PAH محسوب می شوند. این ترکیبات که از سوختن ناقص نفت و محصولات آن مانند بنزین، گازوئیل، مازوت و... آزاد می شوند در بسیاری از موارد حتی در محصولات خام هم مشاهده می شوند. پایرن یک ترکیب چهار حلقه ای می باشد و علاوه بر ترکیبات نفتی از سوختن ناقص ترکیبات زیستی نیز حاصل می شود. فنانترن یک ترکیب چند حلقه ای آروماتیک می باشد و از سه حلقه بنزنی تشکیل شده است. این ترکیب بسیارسمی علاوه بر مشتقات نفتی در دود سیگار هم به وفور یافت می شود. در این مطالعه قصد داریم با بررسی اثرات سمی این دو ترکیب نفتی عوارض ژنوتوکسیکی آنها را با استفاده از تکنیک Comet Assay بر روی سلول های یوکاریوت فیبروبلاست پوست انسان بررسی کنیم. روش اجرا نمونه های پوست forskin از بخش جراحی بیمارستان جمع آوری شده و به اتاق کشت مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی منتقل می شود. پس از جداسازی و کشت در محیط DMEM، غلظت های ۰.۱ و۱ و ۱۰ppm از ترکیبات فنانترن و پایرن را به طور جداگانه در پلیت های شش خانه برای ۴۸ ساعت اثر می دهیم پس از آن آزمون کامت اسی را مطابق پروتکل بر روی سلول ها انجام می دهیم. آماده کردن اسلاید تهیه لایه اول اسلاید، تهیه لایه دوم اسلاید. تهیه لایه سوم اسلاید: مرحله لیز شدن سلولی: بعد از اینکه ژل های سه لایه آگاروز روی اسلاید جامد شدند، اسلایدها به مدت یک شب در محلول لیز کننده قرار داده می شوند. مرحله باز شدن سوپرکویل ها : مرحله الکتروفورز : بعد از باز شدن تک زنجیره (ss DNA) DNA، ژل های آگاروز تحت شرایط قلیایی با ولتاژ V۲۵ وmA ۳۰۰ الکتروفورز می شوند.مرحله خنثی سازی مرحله رنگ آمیزی و مشاهده :Comet در این مرحله برای رنگ آمیزی DNA از اتیدیوم بروماید با غلظت g/mlµ۲۰ استفاده می شود. سلول های مورد مطالعه را با استفاده از نرم افزار Casp تصویر برداری و مورد مطالعه قرار می دهیم. سپس با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون ANOVA مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار می دهیم. از هر غلظت سه اسلاید تهیه می شود. و برای هر غلظت ۱۰۰ تصویر سلولی مورد بررسی قرار می گیرد. از میکروسکوپ فلورسنت جهت مطالعه اسلایدها استفاده می شود. ضمنا میزان تبخیر به کمک یک ظرف حاوی ترکیبات فنانترن و پایرن محاسبه می شود. یافته ها در این مطالعه، سنجش دنباله‌دار قلیایی بر روی HDFهای سالم (کنترل منفی) و سلول‌های در معرض تیمار H2O2 (کنترل مثبت) برای ایجاد آسیب DNA انجام شد. شکستگی های تک رشته ای DNA و DNA آسیب دیده در گروه کنترل مثبت مشاهده شد اما در HDF های سالم DNA طبیعی بدون آسیب نشان داده شد (شکل 3). همچنین این آزمایش به منظور ارزیابی پایداری سیتوژنتیک HDFهای تیمار شده با غلظت های مختلف (.1و1و10ppm) فنانترن و پیرن انجام شد. پارامترهای سنجش دنباله دار شامل ناحیه سر، ناحیه دم، DNA سر، DNA دم، طول دم، طول دنباله دار و ممان دم در HDF های سالم، کنترل مثبت و غلظت های مختلف (0.1و1و10ppm) فنانترن و pyren توسط نرم افزار CaspLab نسخه 1.0.0 محاسبه شد. رابطه و تجزیه و تحلیل تفاوت بین هر غلظت و کنترل مثبت و همچنین HDFهای سالم با استفاده از آزمون ANOVA مورد ارزیابی قرار گرفت. P-value 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. با توجه به نتایج بدست آمده میانگین پارامتر DNA درصد دم در غلظت بالا (1ppm) فنانترن و پیرن در سلول های در معرض افزایش نسبت به غلظت پایین و بالعکس درصد DNA سر کاهش یافت. علاوه بر این، آسیب های DNA و دم بلند مانند کنترل مثبت (H2O2) در غلظت بالای فنانترن و پیرن در مقایسه با HDF های معمولی (بدون آسیب DNA) مشاهده شد. مقایسه پارامترهای سنجش دنباله دار قلیایی به ویژه درصد DNA سر و درصد DNA دم بین هر غلظت فنانترن و پیرن و سایر گروه ها (کنترل مثبت و HDF های سالم) با آزمون ANOVA نشان داد که تفاوت معنی داری بیشتر دارند (05/0p<) . بحث و نتیجه گیری فنانترن و پیرن آلاینده‌های مهم زیست‌محیطی و یکی از پیامدهای سلامت انسان هستند که می‌توانند آسیب‌های DNA ایجاد کنند. بنابراین، در مطالعه حاضر برای اولین بار اثرات سیتوژنتیکی این مواد شیمیایی PAH بر HDFs با استفاده از روش دنباله دار قلیایی مورد ارزیابی قرار گرفت. ما از تیمارهای H2O2 برای القای آسیب DNA در کشت HDF به عنوان کنترل مثبت سنجش ستاره دنباله دار استفاده کردیم. پس از تجزیه و تحلیل پارامترهای سنجش دنباله‌دار قلیایی در غلظت‌های بالای فنانترن و پیرن، درصد DNA دم در سلول‌های در معرض افزایش و درصد DNA سر نسبت به فیبروبلاست‌های معمولی و شاهد مثبت کاهش یافت. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل پایداری سیتوژنتیک HDFهای مواجهه با غلظت‌های مختلف فنانترن و پیرن در مقایسه با HDFهای معمولی و گروه‌های کنترل مثبت با آزمون ANOVA نشان داد که پارامترهای سنجش دنباله‌دار قلیایی شامل مساحت دم، DNA سر، DNA دم، طول دم و دم است. لحظه ای تفاوت معنی داری داشت (05/0p<). این نتایج نشان داد که فنانترن و پیرن جهش‌زا و سرطان‌زا هستند که می‌توانند آسیب‌های DNA را با دنباله‌دار دم بلند در فیبروبلاست پوستی ایجاد کنند. این مواد شیمیایی PAH قادر به القای جهش در ژنوم با شکستگی های تک و دو رشته ای در DNA هستند . مطالعات قبلی نشان داد که PAH ها دارای خواص سرطان زایی، تراتوژنیک و جهش زا هستند و قرار گرفتن در معرض این ترکیبات می تواند باعث ایجاد ضایعات DNA شود . مطالعات دیگر در مورد بیماری های شغلی نفت و نفت نشان داد که در افراد تماس نزدیک با PAH ها با انواع سرطان های مزمن از جمله سرطان کبد، پوست، کلیه، مثانه، ریه، بیضه و سینه مرتبط است . ارزیابی سمیت ژنتیکی سلول‌های خونی در معرض رسوبات و PAH در ماهی دست و پا کردن (Paralichthys olivaceus) با استفاده از سنجش دنباله‌دار که توسط Woo و همکارانش در سال 2006 انجام شد، نشان داد که تفاوت معنی‌داری در شکست DNA بین سلول‌های در معرض در مقایسه با شاهد غیرمعرض وجود دارد. همچنین، مطالعه آنها نشان داد که سنجش دنباله دار تکنیک خوبی برای نظارت بر سمیت ژنتیکی PAHs و رسوبات دریایی در موجودات دریایی است . مطالعه Tannheimer و همکاران. نشان داد که PAH های سرطان زا باعث افزایش کلسیم داخل سلولی و تکثیر سلولی در سلول های اپیتلیال پستان اولیه انسان می شود . سولهاوگ و همکاران نشان داده شد که ترکیبات PAHs مانند پیرن با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و فلوسیتومتری، سیگنال‌های آپوپتوز و ضد آپوپتوز را در سلول‌های Hepa1c1c7 القا می‌کنند . همچنین، PAH ها می توانند جهش زایی را در ژن های تنظیمی و کلیدی مانند ژن های p53 و ras که نقش مهمی در سیستم ترمیم DNA و کنترل چرخه سلولی ایفا می کنند، القا کنند . بنابراین، جهش در سیستم های تنظیم کننده ژن، تنظیم فعالیت های سلولی مانند تکثیر، تمایز، آپوپتوز و ترمیم DNA را مختل می کند و می تواند منجر به آسیب های شدید در سلول ها و ژن ها شود . دنیسنکو و همکاران نشان داده شد که بنزو [α] پیرن (BaP) سرطان‌زای شیمیایی است و باعث ایجاد نقاط حساس جهشی در ژن P53 مرتبط با سرطان ریه می‌شود . PAH ها مانند 7، 12-دی متیل بنز[α] آنتراسن (DMBA) و BaP اثرات مهمی بر مسیرهای سیگنالینگ Ca2+ در سلول های لنفاوی موش و انسان دارند.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها در این مطالعه، سنجش دنباله‌دار قلیایی بر روی HDFهای سالم (کنترل منفی) و سلول‌های در معرض تیمار H2O2 (کنترل مثبت) برای ایجاد آسیب DNA انجام شد. شکستگی های تک رشته ای DNA و DNA آسیب دیده در گروه کنترل مثبت مشاهده شد اما در HDF های سالم DNA طبیعی بدون آسیب نشان داده شد (شکل 3). همچنین این آزمایش به منظور ارزیابی پایداری سیتوژنتیک HDFهای تیمار شده با غلظت های مختلف (.1و1و10ppm) فنانترن و پیرن انجام شد. پارامترهای سنجش دنباله دار شامل ناحیه سر، ناحیه دم، DNA سر، DNA دم، طول دم، طول دنباله دار و ممان دم در HDF های سالم، کنترل مثبت و غلظت های مختلف (0.1و1و10ppm) فنانترن و pyren توسط نرم افزار CaspLab نسخه 1.0.0 محاسبه شد. رابطه و تجزیه و تحلیل تفاوت بین هر غلظت و کنترل مثبت و همچنین HDFهای سالم با استفاده از آزمون ANOVA مورد ارزیابی قرار گرفت. P-value 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. با توجه به نتایج بدست آمده میانگین پارامتر DNA درصد دم در غلظت بالا (1ppm) فنانترن و پیرن در سلول های در معرض افزایش نسبت به غلظت پایین و بالعکس درصد DNA سر کاهش یافت. علاوه بر این، آسیب های DNA و دم بلند مانند کنترل مثبت (H2O2) در غلظت بالای فنانترن و پیرن در مقایسه با HDF های معمولی (بدون آسیب DNA) مشاهده شد. مقایسه پارامترهای سنجش دنباله دار قلیایی به ویژه درصد DNA سر و درصد DNA دم بین هر غلظت فنانترن و پیرن و سایر گروه ها (کنترل مثبت و HDF های سالم) با آزمون ANOVA نشان داد که تفاوت معنی داری بیشتر دارند (05/0p<) .

فایل های پژوهش