پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله پوست خارجی¬ترین وگسترده¬ترین عضو بدن انسان، درمعرض آسیب¬های فراوانی قراردارد، لذا درمان صحیح و مراقبت از زخم¬پوستی، جهت افزایش سرعت بهبود، همچنین جلوگیری ازعوارض آن، مدنظر است(1). دراین مطالعه، تمرکز برروی درمان زخم¬سوختگی درجه2 درمدل حیوانی بااستفاده ازسلول¬های بنیادی مزانشیمی آلوژن به همراه کلاژن بومی بوده است. جداسازی سلول¬های بنیادی ازمغزاستخوان¬های فمور وتیبیای موش صحرایی با روش فلاشینگ انجام شد که حدود یک ماه برای رسیدن به سلول اولیه با تراکم مناسب برای پاساژ سلولی زمان لازم بود(2). کلاژن بومی نیز با استفاده از روش هضم¬اسیدی از دم¬موش استخراج شد و پس از فرآوری بصورت داربست هیدروژلی برای سلو¬ل¬ها مورد استفاده قرار گرفت(3). با استفاده از کوتر استانداردشده سوختگی درجه2 مربعی به اندازه 2در2 سانتی¬متر برپشت موش¬صحرایی ایجاد گردید و سپس آزمایش در 4 گروه درمانی و 1 گروه کنترل (درمان روتین) انجام شد. در مقایسه انجام شده در مورد 5 گروه آزمایشی پس از درمان ونمونه¬برداری، میزان موفقیت درگروه درمان شده با استفاده ازسلول بنیادی مزانشیمی به همراه کلاژن بهتر ازسایر گروه¬ها برآورده گردید. تلاش محققین این پروژه منجر به دستیابی به روش درمانی برای بهبود سریع¬تر سوختگی درجه 2 درمدل حیوانی نسبت درمان¬های رایج گردید. نتایج بررسی¬های ماکروسکوپی، پاتولوژی وبیان ژن¬های دخیل در ترمیم پوست و رگ¬زایی درسطح RNA، بیانگر تسریع در روند بهبود زخم، توسط گروه درمانی کلاژن و سلول بنیادی نسبت به سایر گروه¬ها بوده است. این درحالی است که حتی سرعت روند بهبود درگروه درمان¬شده با کلاژن بدون سلول نیز، نسبت به گروه کنترل بالاتر بوده است. دراین پژوهش علاوه بر اثردرمانی سلو¬های بنیادی مزانشیمی، مورفولوژی، زیست¬سازگاری، زیست¬تخریب¬پذیری و فعالیت زیستی داربست هیدروژلی کلاژن نیز در جهت درمان سوختگی درجه 2 مورد بررسی قرارگرفت. باتوجه به استفاده ازداربست طبیعی کلاژن و سلول بنیادی آلوژن درشرایط طبیعی یعنی برروی نمونه حیوانی و نزدیک بودن حیوان به ابعاد انسانی، در صورت موفقیت پروژه می¬توانیم از نتایج آن برای ورود و یا عدم ورود به کلینیکال ترایال بهره ببریم. استفاده از انواع مختلف داربست¬های طبیعی برپایه¬ی کلاژن و همین¬طور سایر داربست¬های زیستی و استفاده هم¬زمان انواع سلول¬های بنیادی بصورت کیلینیکال ترایال می¬توانند مراحل بعدی وپروژه¬های جدیدی باشند که با توجه به محدودیت منابع در قالب پروژه بعدی صورت خواهد گرفت. روش اجرا خلاصه اجرایی (Executive Summary) دراین تحقیق سلول¬های بنیادی مزانشیمی بدست آمده ازمغز استخوان¬های فمور و تیبیای موش صحرایی (BMMSCs) Bone Marrow Mesenchymal Stem Celss برای انتقال به سطح زخم توسط داربست هیدروژلی کلاژن استخراج شده از دم موش صحرایی، به¬منظور تسریع روند بهبود زخم سوختگی پوستی درمدل موشی، درنظر گرفته شده¬اند. جداسازی سلول¬های بنیادی مزانشیمی از مغزاستخوان موش صحرایی، کشت و تکثیر این سلول¬ها در مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد صورت پذیرفت. تعیین ماهیت مزانشیمی سلول¬های استخراج شده از طریق مشاهدات مورفولوژیک با میکروسکوپ اینورت که بیانگر موروفولوژی فیبروبلاستی وتکثیر سلو¬ل¬های چسبنده و ایجاد توده¬های سلولی به صورت کلونی فیبروبلاستی (CFU-F) بود و همینطور بررسی و تایید فعالیت آلکالین فسفاتاز به منظور تأیید هویت استرومایی سلول¬های MSC وایمنوسیتوشیمی CD71 نشان داده شد. نتایج بررسی¬ ایمنوسیتوشیمی نیز نشان داد سیتوپلاسم سلول¬های بنیادی مغز استخوان به آلکالین فسفاتاز واکنش مثبت نشان داده و به رنگ صورتی دیده شدند. همینطور این سلول¬ها به آنتی بادی CD71 نیز واکنش مثبت نشان دادند. کلاژن از فیبرهای موجود در دم موش صحرایی به روش هضم اسیدی با استیک اسید استخراج شد و پس از فرآوری جهت ژله¬ای شدن و تعیین زمان ژل شدن هیدروژل با استفاده از روش وارونه کردن لوله آزمایش در دمای 37 درجه و تنظیم pH، مورد استفاده قرار گرفت. مدت زمان 7 دقیقه، به عنوان زمان تشکیل ژل جهت انتقال سلول به هیدروژل، درنظر گرفته شد. با توجه به نقش داربست هیدروژلی کلاژن جهت نگهداری و انتقال سلول¬ها به محل زخم و در پاسخ به اینکه آیا این داربست می-تواند نقش مثبتی به همراه سلول بنیادی و یا به¬طور مستقیم بر بهبود زخم داشته باشد، در ابتدا بررسی مورفولوژی، زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و فعالیت زیستی داربست هیدروژلی کلاژن انجام شد. جهت بررسی ریز ساختار، اندازه و مورفولوژی داربست هیدروژلی کلاژن، عکس برداری با میکروسکوپ الکترونی (SEM) انجام و مورد آنالیز قرارگرفت. نتیجه این آنالیز بیانگر تخلخل و به¬هم پیوستگی منافذ جهت بهبود نفوذ سلول به درون داربست و تسهیل تکثیر سلول درون داربست بود. بر روی داربست پس از تنظیم pH و استلریزاسیون به منظور سنجش زیست سازگاری، آزمون کشت سلول بنیادی مزانشیمی، پس از شمارش سلولی، با کاشت حدود 30000 سلول، در محیط کشت DMEM صورت پذیرفت و در نهایت آنالیز MTT انجام شد و میزان زنده ماندن سلول¬ها در 24، 48 و 72 ساعت محاسبه گردید. نتایج نشان¬دهنده روند افزایشی میزان زنده-مانی و تکثیر سلول¬ها طی روزهای آزمایش بود که این امر بیانگر زیست سازگاری و عدم سمیت کلاژن برای تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی است. آزمایشات جانوری نیز در لانه حیوانات و مرکزتحقیقات سلولی و ملکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد انجام شد. باتوجه به تجربیات قبلی تعداد 48 عدد موش صحرایی بالغ نژاد ویستار با وزن 250 تا 300 گرم در 4 گروه درمانی و 1 گروه کنترل (درمان روتین)، به عنوان نمونه مورد بررسی قرارگرفتند. جهت ایجاد مدل زخم سوختگی درجه 2 از یک کوتر دست ساز استاندارد شده استفاده شد و پس از انجام بیهوشی، موزدایی از پشت موش¬ها انجام شد و سپس سوختگی درجه 2 مربعی به ابعاد 2 سانتی¬متر در 2 سانتی¬متر حاصل گردید. سطح سوخته و مرده پوست به هدف ارتباط مستقیم داربست و سلول با بافت زنده به میزان 1×1 سانتی¬متر جراحی و دبریدمان شد. صفحات سیلیکونی جهت نگهداری و پایداری داربست حاوی سلول بر روی زخم¬ها و جلوگیری از انقباض زخم اطراف زخم قرار گرفته و بخیه شدند. درمان¬های مورد نظر شامل هیدروژل کلاژن به تنهایی، هیدروژل کلاژن حاوی سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن، کلات پلاسما به تنهایی و کلات پلاسما حاوی سلول ینیادی مزانشیمی، همینطور درمان روتین (کنترل) در شرایط یکسان انجام پذیرفت. برای زخم سوختگی عموما چهار زمان برداشت نمونه 7، 14، 21 و 28 روز در نظر گرفته می¬شود. طی این روزها برای بررسی روند ظاهری بهبود زخم سوختگی در زمان-های مختلف تصاویر ترتیبی (بررسی ماکروسکوپی) از زخم¬های سوختگی از هریک از نمونه¬های گروه¬های مختلف که شرایط یکسانی داشتند تهیه شد. نمونه¬برداری از محل درمان زخم برای انجام آزمون¬ هیستولوژی (بررسی میکروسکوپی) به روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H & E) همینطور آزمون¬های ملکولی صورت پذیرفت و روند ترمیم زخم از نظر اپی¬تلیال-سازی، ساخت عروق جدید یا آنژیوژنز و عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم مورد بررسی قرار گرفت. در بررسی¬های ماکروسکوپی مشاهده شد که روند بهبود زخم¬های حاصل از سوختگی تیمار شده با داربست¬های سلول¬دار از زخم¬های تیمار شده با داربست بدون سلول بهتر و روند بهبود زخم¬های داربست بدون سلول از زخم کنترل بهتر است. تصاویر هیستوشیمیایی حاصل از لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین نیز نشان داد که روند ترمیم زخم در داربست¬های سلول¬دار نسبت به زخم¬های داربست بدون سلول بهتر و روند ترمیم زخم¬های داربست بدون سلول از گروه کنترل با درمان روتین بهتر بود. در مقایسه انواع داربست¬های سلول¬دار و بدون سلول، در گروه تیمار با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار به نسبت سایرین، عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم نمایان¬تر بود و اپی¬تلیال سازی، انسجام پوست، تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی، کلاژن سازی و آنژیوژنز در زخم با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار در مقایسه با انواع دیگر بسیار بهتر است. سنجش کیفیت RNA کل استخراج شده برای نمونه¬های تهیه شده از محل زخم گروه¬های درمان شده و کنترل، بر روی ژل آگارز با غلظت 5/1% با مشاهده باندهای RNAهای ریبوزومی S18 و S28 صحت استخراج را تایید نمود، همینطور غلظت RNA استخراج شده برحسب نانوگرم بر میکرولیتر با استفاده از نانودراپ تعیین شد. نتایج سنجش غلظت، مابین 2000 تا 3000 نانوگرم در میکرولیتر و نسبت جذب نوری در طول موج¬های 280 و 260 نانومتر مابین 8/1 تا 2 محاسبه شد که بیان کننده خلوص نمونه استخراجی بود. واکنش ساخت cDNA پس از تیمار RNA با آنزیم DNase I به¬وسیله کیت Fermentas-k1622 صورت پذیرفت. انتخاب پرایمر برای ژن¬ها براساس نکات استاندارد طراحی پرایمر انجام پذیرفت. سپس جهت تعیین رقت بهینه از پرایمرها و cDNA به منظور بالابردن حساسیت واکنش Real-time PCR، رقت¬های مختلف از پرایمر و از یک نوع cDNA تهیه گردید و واکنش Real-time PCR برای هرکدام ازاین رقت¬ها به¬صورت 3 تکرار انجام شد. نتایج نشان دهنده رقت بهینه 600/600pM برای پرایمرهای F و R و رقت 1/(100 ) از cDNA مورد نظر بود. در بررسی به روش RT-PCR، بیان ژن¬های دخیل در فرآیندهای ترمیمی و رگ¬زایی شامل Ang، Col1، Col3و VEGFa، درکنار ژن رفرنس GAPDH، ارزیابی و مورد آنالیز قرار گرفت. در بررسی الگوی بیان ژن¬های ذکرشده، درگروه¬های آزمایشی و کنترل (درمان روتین) مشاهده شد که میزان بیان نیمه¬کمی تمامی ژن¬ها ، به¬خصوص در روز 28 در گروه¬های آزمایشی، افزایش معنی¬داری (05/0 ≥ p ) نسبت به گروه کنترل نشان می¬دهد و همینطور میزان بیان هیچکدام ازژن¬ها درگروه کنترل درهیچ¬یک از روزهای 7، 14، 21 و 28 نسبت به گروه¬های آزمایشی افزایش معنی¬داری را نشان نداد. یافته ها یافته¬ها (Results) 3-1-4-1-تعیین هویت و سلامت سلول¬های مزانشیمی مغز استخوان به¬واسطه مشاهده مورفولوژی MSCs در محیط¬کشت مورفولوژی فیبروبلاستی شکل دارند و به ظروف کشت متصل می¬شوند. کشت اولیه (شکل A1)، معمولا به مدت چند روز حفظ می¬شود، بعد از چند روز سلول¬های چسبنده تکثیر یافته و توده¬های سلولی به صورت واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی (CFU-F) را تشکیل می¬دهند (شکل B1)، در طی این مدت سلول¬های غیر چسبنده ( (HSCsبا تعویض محیط ﺣﺬف می¬شوند و معمولاً پس از ﮔﺬشت حدود ده روز از استخراج، کف ظرف کشت پر می¬شود که می‌توان در شکل1 (C)مشاهده نمود .به‌دنبال پاساژهای مکرر، از تعداد سلول‌های رده خونی کاسته و به سلول‌های مزانشیمی افزوده شد، این سلول‌ها توانایی اتصال به کف ظرف کشت را دارند و از سرعت تکثیر بالایی برخوردارند. شکل1(D) پاساژ سوم را نشان می¬دهد که در آن عمده سلول‌های باقی مانده در فلاسک از نوع مزانشیمی بودند، سلول¬ها با دو مورفولوژی شبه فیبروبلاستی و برخی از سلول¬ها به صورت پهن و از نظر اندازه بزرگتر از سایر سلول¬ها در محیط کشت دیده می¬شدند (شکل3-1). شکل 3-1-تصاویر سلول¬های بنیادی مغزاستخوان موش صحرایی در محیط کشت با میکروسکوپ اینورت. A: کشت اولیه با مورفولوژی فیبروبلاستی تا 5 روز بعد ازکشت، B: تکثیر سلول¬های چسبنده و ایجاد توده¬های سلولی به صورت واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی (CFU-F)، C: حذف سلول¬های غیرچسبنده ( (HSCsبا تعویض محیط و پر شدن کف ظرف کشت تا 10 روز بعد از کشت، D: پاساژ سوم سلول¬های MSC. (بزرگنمایی عدسی 4×) 3-1-4-2-بررسی خواص فیزیکی هیدروژل کلاژن پس از اینکه کلاژن ازدم رت استخراج شد، محلول کلاژن به منظور تایید اندازه منافذ به مدت 12 ساعت در یخچال 4 درجه سانتی¬گراد، سپس 12 ساعت منفی 20 و در نهایت 24 ساعت در فریزر منفی 80 و سپس 24 ساعت در دستگاه خشک کن انجمادی قرار گرفت. سپس از نمونه تصویر میکروسکوپ الکترونی تهیه شد. تخلخل، به هم پیوستگی منافذ و همچنین ریخت شناسی کلاژن با میکروسکوپ الکترونی بررسی شد (شکل 3-2). سطح داربست کلاژنی به¬طور کامل متخلخل بود، افزون بر این، داربست به هم¬پیوسته است. وجود به¬هم¬پیوستگی در داربست، افزون بر بهبود نفوذ سلول به درون داربست، باعث تسهیل تکثیر و مهاجرت سلول درون داربست نیز می¬شود. شکل 3-2-تصویر SEM از کلاژن نوع اول خشک شده به روش انجمادی به منظور بررسی ساختار فیزیکی 3-1-4-3-تعیین هویت سلول¬های بنیادی مزانشیمی مغزاستخوان با استفاده از نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز به منظور بررسی ماهیت مزانشیمی سلول‌های چسبیده به پتری دیش¬های کوت شده با ژلاتین و تائید منشأ مزانشیمی آن¬ها از روش ایمونوسیتوشیمیCD71 و آلکالین فسفاتاز استفاده شد. در (شکل 3-3) (A)، با استفاده از آنتی‌بادی CD71 مشخص شد که عمده سلول‌های چسبیده به لامل واکنش مثبت به آنتی‌بادی فوق را نشان دادند. و نیز در (شکل3-3) (B) واکنش مثبت سلول‌ها نسبت به آنزیم آلکالین فسفاتاز نشان داده شده است. سیتوپلاسم سلول‌های مزانشیمی محتوی این آنزیم که واکنش مثبت به نشانگر آلکالین فسفاتاز نشان داده‌اند، به رنگ صورتی دیده می¬شود. شکل 3-3- شناسایی سلول¬های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی. A: سلول¬های مزانشیمی مغز استخوان که به آنتی‌بادی CD71 واکنش مثبت نشان داده‌اند، B: ایمونوسیتوشیمی سلول¬های مزانشیمی با روش آلکالین فسفاتاز یک مرحله‌ای، سیتوپلاسم سلول¬هایی که واکنش مثبت نشان داده‌اند، به رنگ صورتی دیده می‌شود. (بزرگنمایی 10×) 3-1-4-4-آزمون زنده¬مانی سلولی برای بررسی زیست سازگاری هیدروژل و همچنین سمیت سلولی آن از آزمون MTT برای هیدروژل کلاژن در روزهای متفاوت در مقایسه با کنترل استفاده شد (شکل 3-4). با توجه به مطالعات پیشین و اثبات زیست سازگاری پلیمر ژلاتین برای سلو¬های مختلف از جمله سلول¬های بنیادی مزانشیمی، هیدروژل از جنس ژلاتین به عنوان معیار زیست سازگاری انتخاب شد و زنده مانی و همچنین تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی موش صحرایی روی هیدروژل کلاژن با این هیدروژل مقایسه شد. درصد زنده مانی سلول¬ها روی دو هیدروژل کلاژن و ژلاتین را طی روزهای 1، 2 و 4 نشان داده شده است (شکل 3-4). روند افزایشی میزان زنده مانی سلول¬ها طی روزهای آزمایش، مشاهده می¬شود. بنابراین، می¬توان نتیجه گرفت که کلاژن، زیست سازگار و فاقد سمیت سلولی بوده و همچنین این هیدروژل بستر مناسبی را برای تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی فراهم می¬سازد. شکل3-4-بررسی درصد زنده مانی سلولی روی داربست¬های کلاژن و ژلاتین(کنترل) در روزهای 1، 2 و 4 (*P < 0.05) 3-1-4-5-نتایج ماکروسکوپی برای بررسی روند ظاهری بهبود زخم سوختگی در زمان¬های مختلف تصاویر ترتیبی از زخم¬های سوختگی از هریک از نمونه¬های گروه¬های مختلف که شرایط یکسانی داشتند تهیه شد. هرچه علائم فازهای بهبود زخم نمایان¬تر و مساحت زخم در یک زمان مشخص کوچک¬تر باشد، نشان دهنده¬ی بهبود بهتر زخم است. در شکل¬های زیر روند بهبود زخم در گزوه کنترل و زخم¬های داربست¬های بدون سلول و داربست¬های سلول¬دار در روزهای 7، 14، 21 و 28 قابل مشاهده است. مشاهده می¬شود که روند بهبود زخم¬های حاصل از سوختگی تیمار شده با داربست¬های سلول¬دار (شکل 3-9) و (شکل 3-10) از زخم-های تیمار شده با داربست بدون سلول (شکل 3-7) و (شکل 3-8) بهتر و روند بهبود زخم¬های داربست بدون سلول از زخم کنترل (شکل 3-6) بهتر است. در مقایسه همه گروه¬های تیمار بهترین روند بهبود مربوط به گروه تیمار شده با داربست هیدروژلی کلاژن و سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن است. شکل 3-5-زخم سوختگی پس از انجام دبریدمان و حذف مقداری از بافت مرده: روز صفر شکل 3-6-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود در گروه کنترل (درمان روتین) شکل 3-7-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از داربست هیدروژلی کلاژن شکل 3-8-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما (Fresh Frozen Plasma) شکل 3-9-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم در گروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن شکل 3-10-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلاژن به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن 3-1-4-6-نتایج پاتولوژی ترمیم زخم سوختگی برای بررسی روند ترمیم زخم معیارهای اپی¬تلیال¬سازی، ساخت عروق جدید یا آنژیوژنز و عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم در این پژوهش مدنظر قرار گرفتند. پس از اتمام ایجاد مدل سوختگی و انجام درمان¬های مورد نظر در گروه¬های تعریف شده و گذشت مدت زمان¬های معین تعیین شده، نمونه¬های کنترل و آزمون از بدن حیوان خارج و در عملیات آماده¬سازی، قالب¬گیری، برش و تهیه لام و لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین قرار گرفتند. لام¬های تهیه شده از مقاطع عرضی زخم به وسیله¬ی میکروسکوپ مشاهده و عکس¬برداری شدند. تصاویر هیستوشیمیایی حاصل از لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین (شکل-های 3-11 تا 3-15) برای نمونه¬های کنترل و انواع گروه¬های دیگر از نوع بدون سلول و سلول¬دار در روزهای 7، 14، 21 و 28 نشان داده شده¬اند. در روز 7، زخم کنترل (شکل 3-11) حاوی مقداری فیبرین و دلمه بوده، اپی¬تلیال سازی انجام نشده است، کلاژن سازی به میزان جزیی صورت گرفته و همینطور آنژیوژنزی مشاهده نمی¬شود. در روز 14 نمونه کنترل دارای مقدار بیشتری فیبریل بوده و اپی¬تلیال سازی بسیار جزیی در حاشیه زخم صورت گرفته است. رشته های کلاژن تراکم بیشتری نسبت به روز 7 رویت شدند و همچنان آنژیوژنز رویت نمی¬شود. در روز 21 اپی¬تلیال سازی جزیی به همراه غدد چربی به صورت جزیی رویت شد. کلاژن سازی نیز صورت گرفته است و آنژیوژنز جزیی شناسایی شد. در روز 28 اپی¬تلیال سازی خوب به همراه وجود فولیکول¬های مو و غدد چربی در حد متوسط رویت شد. کلاژن سازی نیز ادامه یافته و آنژیوژنز متوسطی رویت شد. در زخم¬های داربست دار بدون سلول (شکل 3-12) و (شکل 3-13) در روز 7 رشته های فیبرینی با تراکم بیشتر رویت شدند. کلاژن سازی قابل تشخیص نیست و آنژیوژنزی هم مشاهده نمی¬شود. در روز 14 نسبت به نمونه کنترل مقدار بیشتری فیبریل وجود دارد و اپی¬تلیال سازی بیشتری در حاشیه زخم صورت گرفته است و رشته¬های کلاژن با تراکم بیشتری رویت شدند، آنژیوژنز ضعیف تا متوسطی رویت شد. در روز 21 نسبت به زخم کنترل اپی¬تلیال سازی مناسب¬تر است و فولیکول¬های مو و غدد چربی نمایان¬ترند. کلاژن سازی نیز صورت گرفته و آنژیوژنز نسبت به زخم منترل کامل¬تر است. در حالی¬که بین دو نوع داربست بدون سلول، در مورد هیدروژل کلاژنی (شکل 3-13) اپی¬تلیال سازی، آنژیوژنز و پیدایش و رشد فولیکول¬های مو نسبت به داربست کلات پلاسما (شکل 3-12) مناسب¬تر و بهتر صورت گرفته است. در بررسی زخم¬های داربست با سلول (شکل 3-14) و (شکل 3-15) نسبت به زخم¬های بدون سلول که جنس داربست یکسان با زخم¬های داربستی سلول¬دار داشتند؛ در روز 7، فیبریل¬های متراکم نامنظم بیشتری دیده می¬شود و کلاژن¬سازی رویت شد. به علاوه آنژیوژنز جزیی در بعضی فیلدها رویت شد. در روز 14 فولیکول¬های مو بروز پیدا کرده اند، کلاژن¬سازی خوب به همراه باندل¬های نامنظم و تشکیل اپی¬تلیال نسبتا کامل و آنژیوژنز بیشتری رویت شد. در روز 21 ترمیم زخم روند پیشرفت خود را ادامه داده و فولیکول¬های مو و غدد چربی نمایان¬ترند. کلاژن سازی با باندل¬های منظم¬ تشخیص داده شد. در روز 28 ترمیم زخم به حد نهایی خود رسیده است و تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی فراوان است. آنژیوژنز به خوبی انجام شده و کلاژن سازی منسجم با باندل¬های منظم¬تر از قبل دیده می¬شود. در مجموع روند ترمیم زخم در داربست¬های سلول¬دار نسبت به زخم¬های داربست بدون سلول بهتر و روند ترمیم زخم¬های داربست بدون سلول از گروه کنترل با درمان روتین بهتر بود. لازم به ذکر است در مقایسه انواع داربست¬های سلول¬دار و بدون سلول، در گروه تیمار با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار (شکل 3-15) به نسبت سایرین، عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم نمایان-تر بود و روند ترمیمی بهتری را با توجه به بررسی¬های میکروسکوپی نشان می¬دهد. همان¬طور که مشاهده می¬شود اپی¬تلیال سازی، انسجام پوست، تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی، کلاژن سازی و آنژیوژنز در زخم با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار (شکل 3-15) در مقایسه با انواع دیگر بسیار بهتر است. شکل3-11-رنگ آمیزی H&E زخم کنترل (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-12-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما (Fresh Frozen Plasma) (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-13-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از داربست هیدروژلی کلاژن (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-14-رنگ آمیزی H&E زخم در گروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-15-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلاژن به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن (بزرگنمایی عدسی 10×) 3-1-4-7-نتایج کیفی مربوط به استخراج RNA در آغاز انجام این بخش از تحقیق، استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA شرکت یکتا تجهیز آزما ایران از روش فنل-کلروفرم انجام شد. در (شکل 3-16) نتایج استخراج RNA در مورد تعدادی از نمونه ها نشان داده شده است. شماره¬های 1 تا 4 همگی نشان¬دهنده غلظت مناسب RNA می-باشند که تخلیص گردیده¬اند. شکل 3-16-تصویر الکتروفورز RNA استخراج شده روی ژل آگارز 5/1 درصد – ستون M: مارکر 1 کیلوجفت بازی شرکت فرمنتاز، ستون¬های 1 تا 4: نمونه های RNA 3-1-4-8-ارزیابی بیان ژن¬های VEGFa، Ang، Col1 و Col3 و بررسی آماری شدت باندها و نمودارهای مربوط به آن 3-1-4-8-1-نتایج رقت¬های متوالی پرایمرها برای واکنش RT-qPCR به منظور تعیین کارایی پرایمرها در بهترین غلظت، با استفاده از رقت‌های مختلف پرایمرها، RT-qPCR با سه تکرار برای هر کدام از رقت‌های تهیه‌شده انجام شد (شکل 3-17) و رقت بهینه pM600/600 انتخاب شد. شکل 3-17-تصویر مربوط به انتخاب غلظت بهترین پرایمر Ang 3-1-4-8-2-نمودار نتایج الکوی بیان ژن در نمونه¬های تیمارشده و کنترل در این مرحله، میزان بیان ژن¬های VEGFa، Ang، Col1و Col3 در بافت¬های کنترل و درمان به روشRT-PCR بررسی شد. در بررسی الگوی بیان این ژن¬ها درگروه¬های آزمایشی و کنترل (درمان روتین) مشاهده شد که میزان بیان نیمه¬کمی تمامی ژن¬های ذکرشده، به¬خصوص در روز 28 در گروه¬های آزمایشی، افزایش معنی¬داری (05/0 ≥ p ) نسبت به گروه کنترل نشان می¬دهد و همینطور میزان بیان هیچکدام ازژن¬ها درگروه کنترل درهیچ¬یک از روزهای 7، 14، 21 و 28 نسبت به گروه¬های آزمایشی افزایش معنی¬داری را نشان نداد. نمودار الگوی بیان این ژن¬ها با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 7 و به روش one-way ANOVA ترسیم شد. شکل 3-18-الگوی میزان بیان ژن VEGFa در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-19-الگوی میزان بیان ژن Ang در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-20-الگوی میزان بیان ژن Col1 در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-21-الگوی میزان بیان ژن Col3 در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* بحث و نتیجه گیری دراین تحقیق سلول¬های بنیادی مزانشیمی بدست آمده ازمغز استخوان¬های فمور و تیبیای موش صحرایی (BMMSCs) Bone Marrow Mesenchymal Stem Celss برای انتقال به سطح زخم توسط داربست هیدروژلی کلاژن استخراج شده از دم موش صحرایی، به¬منظور تسریع روند بهبود زخم سوختگی پوستی درمدل موشی، درنظر گرفته شده¬اند. جداسازی سلول¬های بنیادی مزانشیمی از مغزاستخوان موش صحرایی، کشت و تکثیر این سلول¬ها در مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد صورت پذیرفت. تعیین ماهیت مزانشیمی سلول¬های استخراج شده از طریق مشاهدات مورفولوژیک با میکروسکوپ اینورت که بیانگر موروفولوژی فیبروبلاستی وتکثیر سلو¬ل¬های چسبنده و ایجاد توده¬های سلولی به صورت کلونی فیبروبلاستی (CFU-F) بود و همینطور بررسی و تایید فعالیت آلکالین فسفاتاز به منظور تأیید هویت استرومایی سلول¬های MSC وایمنوسیتوشیمی CD71 نشان داده شد. نتایج بررسی¬ ایمنوسیتوشیمی نیز نشان داد سیتوپلاسم سلول¬های بنیادی مغز استخوان به آلکالین فسفاتاز واکنش مثبت نشان داده و به رنگ صورتی دیده شدند. همینطور این سلول¬ها به آنتی بادی CD71 نیز واکنش مثبت نشان دادند. کلاژن از فیبرهای موجود در دم موش صحرایی به روش هضم اسیدی با استیک اسید استخراج شد و پس از فرآوری جهت ژله¬ای شدن و تعیین زمان ژل شدن هیدروژل با استفاده از روش وارونه کردن لوله آزمایش در دمای 37 درجه و تنظیم pH، مورد استفاده قرار گرفت. مدت زمان 7 دقیقه، به عنوان زمان تشکیل ژل جهت انتقال سلول به هیدروژل، درنظر گرفته شد. با توجه به نقش داربست هیدروژلی کلاژن جهت نگهداری و انتقال سلول¬ها به محل زخم و در پاسخ به اینکه آیا این داربست می-تواند نقش مثبتی به همراه سلول بنیادی و یا به¬طور مستقیم بر بهبود زخم داشته باشد، در ابتدا بررسی مورفولوژی، زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و فعالیت زیستی داربست هیدروژلی کلاژن انجام شد. جهت بررسی ریز ساختار، اندازه و مورفولوژی داربست هیدروژلی کلاژن، عکس برداری با میکروسکوپ الکترونی (SEM) انجام و مورد آنالیز قرارگرفت. نتیجه این آنالیز بیانگر تخلخل و به¬هم پیوستگی منافذ جهت بهبود نفوذ سلول به درون داربست و تسهیل تکثیر سلول درون داربست بود. بر روی داربست پس از تنظیم pH و استلریزاسیون به منظور سنجش زیست سازگاری، آزمون کشت سلول بنیادی مزانشیمی، پس از شمارش سلولی، با کاشت حدود 30000 سلول، در محیط کشت DMEM صورت پذیرفت و در نهایت آنالیز MTT انجام شد و میزان زنده ماندن سلول¬ها در 24، 48 و 72 ساعت محاسبه گردید. نتایج نشان¬دهنده روند افزایشی میزان زنده-مانی و تکثیر سلول¬ها طی روزهای آزمایش بود که این امر بیانگر زیست سازگاری و عدم سمیت کلاژن برای تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی است. آزمایشات جانوری نیز در لانه حیوانات و مرکزتحقیقات سلولی و ملکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد انجام شد. باتوجه به تجربیات قبلی تعداد 48 عدد موش صحرایی بالغ نژاد ویستار با وزن 250 تا 300 گرم در 4 گروه درمانی و 1 گروه کنترل (درمان روتین)، به عنوان نمونه مورد بررسی قرارگرفتند. جهت ایجاد مدل زخم سوختگی درجه 2 از یک کوتر دست ساز استاندارد شده استفاده شد و پس از انجام بیهوشی، موزدایی از پشت موش¬ها انجام شد و سپس سوختگی درجه 2 مربعی به ابعاد 2 سانتی¬متر در 2 سانتی¬متر حاصل گردید. سطح سوخته و مرده پوست به هدف ارتباط مستقیم داربست و سلول با بافت زنده به میزان 1×1 سانتی¬متر جراحی و دبریدمان شد. صفحات سیلیکونی جهت نگهداری و پایداری داربست حاوی سلول بر روی زخم¬ها و جلوگیری از انقباض زخم اطراف زخم قرار گرفته و بخیه شدند. درمان¬های مورد نظر شامل هیدروژل کلاژن به تنهایی، هیدروژل کلاژن حاوی سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن، کلات پلاسما به تنهایی و کلات پلاسما حاوی سلول ینیادی مزانشیمی، همینطور درمان روتین (کنترل) در شرایط یکسان انجام پذیرفت. برای زخم سوختگی عموما چهار زمان برداشت نمونه 7، 14، 21 و 28 روز در نظر گرفته می¬شود. طی این روزها برای بررسی روند ظاهری بهبود زخم سوختگی در زمان-های مختلف تصاویر ترتیبی (بررسی ماکروسکوپی) از زخم¬های سوختگی از هریک از نمونه¬های گروه¬های مختلف که شرایط یکسانی داشتند تهیه شد. نمونه¬برداری از محل درمان زخم برای انجام آزمون¬ هیستولوژی (بررسی میکروسکوپی) به روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H & E) همینطور آزمون¬های ملکولی صورت پذیرفت و روند ترمیم زخم از نظر اپی¬تلیال-سازی، ساخت عروق جدید یا آنژیوژنز و عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم مورد بررسی قرار گرفت. در بررسی¬های ماکروسکوپی مشاهده شد که روند بهبود زخم¬های حاصل از سوختگی تیمار شده با داربست¬های سلول¬دار از زخم¬های تیمار شده با داربست بدون سلول بهتر و روند بهبود زخم¬های داربست بدون سلول از زخم کنترل بهتر است. تصاویر هیستوشیمیایی حاصل از لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین نیز نشان داد که روند ترمیم زخم در داربست¬های سلول¬دار نسبت به زخم¬های داربست بدون سلول بهتر و روند ترمیم زخم¬های داربست بدون سلول از گروه کنترل با درمان روتین بهتر بود. در مقایسه انواع داربست¬های سلول¬دار و بدون سلول، در گروه تیمار با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار به نسبت سایرین، عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم نمایان¬تر بود و اپی¬تلیال سازی، انسجام پوست، تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی، کلاژن سازی و آنژیوژنز در زخم با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار در مقایسه با انواع دیگر بسیار بهتر است. سنجش کیفیت RNA کل استخراج شده برای نمونه¬های تهیه شده از محل زخم گروه¬های درمان شده و کنترل، بر روی ژل آگارز با غلظت 5/1% با مشاهده باندهای RNAهای ریبوزومی S18 و S28 صحت استخراج را تایید نمود، همینطور غلظت RNA استخراج شده برحسب نانوگرم بر میکرولیتر با استفاده از نانودراپ تعیین شد. نتایج سنجش غلظت، مابین 2000 تا 3000 نانوگرم در میکرولیتر و نسبت جذب نوری در طول موج¬های 280 و 260 نانومتر مابین 8/1 تا 2 محاسبه شد که بیان کننده خلوص نمونه استخراجی بود. واکنش ساخت cDNA پس از تیمار RNA با آنزیم DNase I به¬وسیله کیت Fermentas-k1622 صورت پذیرفت. انتخاب پرایمر برای ژن¬ها براساس نکات استاندارد طراحی پرایمر انجام پذیرفت. سپس جهت تعیین رقت بهینه از پرایمرها و cDNA به منظور بالابردن حساسیت واکنش Real-time PCR، رقت¬های مختلف از پرایمر و از یک نوع cDNA تهیه گردید و واکنش Real-time PCR برای هرکدام ازاین رقت¬ها به¬صورت 3 تکرار انجام شد. نتایج نشان دهنده رقت بهینه 600/600pM برای پرایمرهای F و R و رقت 1/(100 ) از cDNA مورد نظر بود. در بررسی به روش RT-PCR، بیان ژن¬های دخیل در فرآیندهای ترمیمی و رگ¬زایی شامل Ang، Col1، Col3و VEGFa، درکنار ژن رفرنس GAPDH، ارزیابی و مورد آنالیز قرار گرفت. در بررسی الگوی بیان ژن¬های ذکرشده، درگروه¬های آزمایشی و کنترل (درمان روتین) مشاهده شد که میزان بیان نیمه¬کمی تمامی ژن¬ها ، به¬خصوص در روز 28 در گروه¬های آزمایشی، افزایش معنی¬داری (05/0 ≥ p ) نسبت به گروه کنترل نشان می¬دهد و همینطور میزان بیان هیچکدام ازژن¬ها درگروه کنترل درهیچ¬یک از روزهای 7، 14، 21 و 28 نسبت به گروه¬های آزمایشی افزایش معنی¬داری را نشان نداد.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها یافته¬ها (Results) 3-1-4-1-تعیین هویت و سلامت سلول¬های مزانشیمی مغز استخوان به¬واسطه مشاهده مورفولوژی MSCs در محیط¬کشت مورفولوژی فیبروبلاستی شکل دارند و به ظروف کشت متصل می¬شوند. کشت اولیه (شکل A1)، معمولا به مدت چند روز حفظ می¬شود، بعد از چند روز سلول¬های چسبنده تکثیر یافته و توده¬های سلولی به صورت واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی (CFU-F) را تشکیل می¬دهند (شکل B1)، در طی این مدت سلول¬های غیر چسبنده ( (HSCsبا تعویض محیط ﺣﺬف می¬شوند و معمولاً پس از ﮔﺬشت حدود ده روز از استخراج، کف ظرف کشت پر می¬شود که می‌توان در شکل1 (C)مشاهده نمود .به‌دنبال پاساژهای مکرر، از تعداد سلول‌های رده خونی کاسته و به سلول‌های مزانشیمی افزوده شد، این سلول‌ها توانایی اتصال به کف ظرف کشت را دارند و از سرعت تکثیر بالایی برخوردارند. شکل1(D) پاساژ سوم را نشان می¬دهد که در آن عمده سلول‌های باقی مانده در فلاسک از نوع مزانشیمی بودند، سلول¬ها با دو مورفولوژی شبه فیبروبلاستی و برخی از سلول¬ها به صورت پهن و از نظر اندازه بزرگتر از سایر سلول¬ها در محیط کشت دیده می¬شدند (شکل3-1). شکل 3-1-تصاویر سلول¬های بنیادی مغزاستخوان موش صحرایی در محیط کشت با میکروسکوپ اینورت. A: کشت اولیه با مورفولوژی فیبروبلاستی تا 5 روز بعد ازکشت، B: تکثیر سلول¬های چسبنده و ایجاد توده¬های سلولی به صورت واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی (CFU-F)، C: حذف سلول¬های غیرچسبنده ( (HSCsبا تعویض محیط و پر شدن کف ظرف کشت تا 10 روز بعد از کشت، D: پاساژ سوم سلول¬های MSC. (بزرگنمایی عدسی 4×) 3-1-4-2-بررسی خواص فیزیکی هیدروژل کلاژن پس از اینکه کلاژن ازدم رت استخراج شد، محلول کلاژن به منظور تایید اندازه منافذ به مدت 12 ساعت در یخچال 4 درجه سانتی¬گراد، سپس 12 ساعت منفی 20 و در نهایت 24 ساعت در فریزر منفی 80 و سپس 24 ساعت در دستگاه خشک کن انجمادی قرار گرفت. سپس از نمونه تصویر میکروسکوپ الکترونی تهیه شد. تخلخل، به هم پیوستگی منافذ و همچنین ریخت شناسی کلاژن با میکروسکوپ الکترونی بررسی شد (شکل 3-2). سطح داربست کلاژنی به¬طور کامل متخلخل بود، افزون بر این، داربست به هم¬پیوسته است. وجود به¬هم¬پیوستگی در داربست، افزون بر بهبود نفوذ سلول به درون داربست، باعث تسهیل تکثیر و مهاجرت سلول درون داربست نیز می¬شود. شکل 3-2-تصویر SEM از کلاژن نوع اول خشک شده به روش انجمادی به منظور بررسی ساختار فیزیکی 3-1-4-3-تعیین هویت سلول¬های بنیادی مزانشیمی مغزاستخوان با استفاده از نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز به منظور بررسی ماهیت مزانشیمی سلول‌های چسبیده به پتری دیش¬های کوت شده با ژلاتین و تائید منشأ مزانشیمی آن¬ها از روش ایمونوسیتوشیمیCD71 و آلکالین فسفاتاز استفاده شد. در (شکل 3-3) (A)، با استفاده از آنتی‌بادی CD71 مشخص شد که عمده سلول‌های چسبیده به لامل واکنش مثبت به آنتی‌بادی فوق را نشان دادند. و نیز در (شکل3-3) (B) واکنش مثبت سلول‌ها نسبت به آنزیم آلکالین فسفاتاز نشان داده شده است. سیتوپلاسم سلول‌های مزانشیمی محتوی این آنزیم که واکنش مثبت به نشانگر آلکالین فسفاتاز نشان داده‌اند، به رنگ صورتی دیده می¬شود. شکل 3-3- شناسایی سلول¬های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی. A: سلول¬های مزانشیمی مغز استخوان که به آنتی‌بادی CD71 واکنش مثبت نشان داده‌اند، B: ایمونوسیتوشیمی سلول¬های مزانشیمی با روش آلکالین فسفاتاز یک مرحله‌ای، سیتوپلاسم سلول¬هایی که واکنش مثبت نشان داده‌اند، به رنگ صورتی دیده می‌شود. (بزرگنمایی 10×) 3-1-4-4-آزمون زنده¬مانی سلولی برای بررسی زیست سازگاری هیدروژل و همچنین سمیت سلولی آن از آزمون MTT برای هیدروژل کلاژن در روزهای متفاوت در مقایسه با کنترل استفاده شد (شکل 3-4). با توجه به مطالعات پیشین و اثبات زیست سازگاری پلیمر ژلاتین برای سلو¬های مختلف از جمله سلول¬های بنیادی مزانشیمی، هیدروژل از جنس ژلاتین به عنوان معیار زیست سازگاری انتخاب شد و زنده مانی و همچنین تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی موش صحرایی روی هیدروژل کلاژن با این هیدروژل مقایسه شد. درصد زنده مانی سلول¬ها روی دو هیدروژل کلاژن و ژلاتین را طی روزهای 1، 2 و 4 نشان داده شده است (شکل 3-4). روند افزایشی میزان زنده مانی سلول¬ها طی روزهای آزمایش، مشاهده می¬شود. بنابراین، می¬توان نتیجه گرفت که کلاژن، زیست سازگار و فاقد سمیت سلولی بوده و همچنین این هیدروژل بستر مناسبی را برای تکثیر سلول¬های بنیادی مزانشیمی فراهم می¬سازد. شکل3-4-بررسی درصد زنده مانی سلولی روی داربست¬های کلاژن و ژلاتین(کنترل) در روزهای 1، 2 و 4 (*P < 0.05) 3-1-4-5-نتایج ماکروسکوپی برای بررسی روند ظاهری بهبود زخم سوختگی در زمان¬های مختلف تصاویر ترتیبی از زخم¬های سوختگی از هریک از نمونه¬های گروه¬های مختلف که شرایط یکسانی داشتند تهیه شد. هرچه علائم فازهای بهبود زخم نمایان¬تر و مساحت زخم در یک زمان مشخص کوچک¬تر باشد، نشان دهنده¬ی بهبود بهتر زخم است. در شکل¬های زیر روند بهبود زخم در گزوه کنترل و زخم¬های داربست¬های بدون سلول و داربست¬های سلول¬دار در روزهای 7، 14، 21 و 28 قابل مشاهده است. مشاهده می¬شود که روند بهبود زخم¬های حاصل از سوختگی تیمار شده با داربست¬های سلول¬دار (شکل 3-9) و (شکل 3-10) از زخم-های تیمار شده با داربست بدون سلول (شکل 3-7) و (شکل 3-8) بهتر و روند بهبود زخم¬های داربست بدون سلول از زخم کنترل (شکل 3-6) بهتر است. در مقایسه همه گروه¬های تیمار بهترین روند بهبود مربوط به گروه تیمار شده با داربست هیدروژلی کلاژن و سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن است. شکل 3-5-زخم سوختگی پس از انجام دبریدمان و حذف مقداری از بافت مرده: روز صفر شکل 3-6-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود در گروه کنترل (درمان روتین) شکل 3-7-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از داربست هیدروژلی کلاژن شکل 3-8-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما (Fresh Frozen Plasma) شکل 3-9-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم در گروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن شکل 3-10-نتایج ماکروسکوپی روند بهبود زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلاژن به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن 3-1-4-6-نتایج پاتولوژی ترمیم زخم سوختگی برای بررسی روند ترمیم زخم معیارهای اپی¬تلیال¬سازی، ساخت عروق جدید یا آنژیوژنز و عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم در این پژوهش مدنظر قرار گرفتند. پس از اتمام ایجاد مدل سوختگی و انجام درمان¬های مورد نظر در گروه¬های تعریف شده و گذشت مدت زمان¬های معین تعیین شده، نمونه¬های کنترل و آزمون از بدن حیوان خارج و در عملیات آماده¬سازی، قالب¬گیری، برش و تهیه لام و لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین قرار گرفتند. لام¬های تهیه شده از مقاطع عرضی زخم به وسیله¬ی میکروسکوپ مشاهده و عکس¬برداری شدند. تصاویر هیستوشیمیایی حاصل از لکه گذاری هماتوکسیلین-ائوزین (شکل-های 3-11 تا 3-15) برای نمونه¬های کنترل و انواع گروه¬های دیگر از نوع بدون سلول و سلول¬دار در روزهای 7، 14، 21 و 28 نشان داده شده¬اند. در روز 7، زخم کنترل (شکل 3-11) حاوی مقداری فیبرین و دلمه بوده، اپی¬تلیال سازی انجام نشده است، کلاژن سازی به میزان جزیی صورت گرفته و همینطور آنژیوژنزی مشاهده نمی¬شود. در روز 14 نمونه کنترل دارای مقدار بیشتری فیبریل بوده و اپی¬تلیال سازی بسیار جزیی در حاشیه زخم صورت گرفته است. رشته های کلاژن تراکم بیشتری نسبت به روز 7 رویت شدند و همچنان آنژیوژنز رویت نمی¬شود. در روز 21 اپی¬تلیال سازی جزیی به همراه غدد چربی به صورت جزیی رویت شد. کلاژن سازی نیز صورت گرفته است و آنژیوژنز جزیی شناسایی شد. در روز 28 اپی¬تلیال سازی خوب به همراه وجود فولیکول¬های مو و غدد چربی در حد متوسط رویت شد. کلاژن سازی نیز ادامه یافته و آنژیوژنز متوسطی رویت شد. در زخم¬های داربست دار بدون سلول (شکل 3-12) و (شکل 3-13) در روز 7 رشته های فیبرینی با تراکم بیشتر رویت شدند. کلاژن سازی قابل تشخیص نیست و آنژیوژنزی هم مشاهده نمی¬شود. در روز 14 نسبت به نمونه کنترل مقدار بیشتری فیبریل وجود دارد و اپی¬تلیال سازی بیشتری در حاشیه زخم صورت گرفته است و رشته¬های کلاژن با تراکم بیشتری رویت شدند، آنژیوژنز ضعیف تا متوسطی رویت شد. در روز 21 نسبت به زخم کنترل اپی¬تلیال سازی مناسب¬تر است و فولیکول¬های مو و غدد چربی نمایان¬ترند. کلاژن سازی نیز صورت گرفته و آنژیوژنز نسبت به زخم منترل کامل¬تر است. در حالی¬که بین دو نوع داربست بدون سلول، در مورد هیدروژل کلاژنی (شکل 3-13) اپی¬تلیال سازی، آنژیوژنز و پیدایش و رشد فولیکول¬های مو نسبت به داربست کلات پلاسما (شکل 3-12) مناسب¬تر و بهتر صورت گرفته است. در بررسی زخم¬های داربست با سلول (شکل 3-14) و (شکل 3-15) نسبت به زخم¬های بدون سلول که جنس داربست یکسان با زخم¬های داربستی سلول¬دار داشتند؛ در روز 7، فیبریل¬های متراکم نامنظم بیشتری دیده می¬شود و کلاژن¬سازی رویت شد. به علاوه آنژیوژنز جزیی در بعضی فیلدها رویت شد. در روز 14 فولیکول¬های مو بروز پیدا کرده اند، کلاژن¬سازی خوب به همراه باندل¬های نامنظم و تشکیل اپی¬تلیال نسبتا کامل و آنژیوژنز بیشتری رویت شد. در روز 21 ترمیم زخم روند پیشرفت خود را ادامه داده و فولیکول¬های مو و غدد چربی نمایان¬ترند. کلاژن سازی با باندل¬های منظم¬ تشخیص داده شد. در روز 28 ترمیم زخم به حد نهایی خود رسیده است و تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی فراوان است. آنژیوژنز به خوبی انجام شده و کلاژن سازی منسجم با باندل¬های منظم¬تر از قبل دیده می¬شود. در مجموع روند ترمیم زخم در داربست¬های سلول¬دار نسبت به زخم¬های داربست بدون سلول بهتر و روند ترمیم زخم¬های داربست بدون سلول از گروه کنترل با درمان روتین بهتر بود. لازم به ذکر است در مقایسه انواع داربست¬های سلول¬دار و بدون سلول، در گروه تیمار با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار (شکل 3-15) به نسبت سایرین، عوامل کلی بیانگر ترمیم زخم نمایان-تر بود و روند ترمیمی بهتری را با توجه به بررسی¬های میکروسکوپی نشان می¬دهد. همان¬طور که مشاهده می¬شود اپی¬تلیال سازی، انسجام پوست، تعداد فولیکول¬های مو و غدد چربی، کلاژن سازی و آنژیوژنز در زخم با داربست هیدروژلی کلاژن سلول¬دار (شکل 3-15) در مقایسه با انواع دیگر بسیار بهتر است. شکل3-11-رنگ آمیزی H&E زخم کنترل (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-12-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما (Fresh Frozen Plasma) (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-13-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از داربست هیدروژلی کلاژن (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-14-رنگ آمیزی H&E زخم در گروه درمان شده با استفاده از کلات پلاسما به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن (بزرگنمایی عدسی 10×) شکل 3-15-رنگ آمیزی H&E زخم درگروه درمان شده با استفاده از کلاژن به همراه سلول بنیادی مزانشیمی آلوژن (بزرگنمایی عدسی 10×) 3-1-4-7-نتایج کیفی مربوط به استخراج RNA در آغاز انجام این بخش از تحقیق، استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA شرکت یکتا تجهیز آزما ایران از روش فنل-کلروفرم انجام شد. در (شکل 3-16) نتایج استخراج RNA در مورد تعدادی از نمونه ها نشان داده شده است. شماره¬های 1 تا 4 همگی نشان¬دهنده غلظت مناسب RNA می-باشند که تخلیص گردیده¬اند. شکل 3-16-تصویر الکتروفورز RNA استخراج شده روی ژل آگارز 5/1 درصد – ستون M: مارکر 1 کیلوجفت بازی شرکت فرمنتاز، ستون¬های 1 تا 4: نمونه های RNA 3-1-4-8-ارزیابی بیان ژن¬های VEGFa، Ang، Col1 و Col3 و بررسی آماری شدت باندها و نمودارهای مربوط به آن 3-1-4-8-1-نتایج رقت¬های متوالی پرایمرها برای واکنش RT-qPCR به منظور تعیین کارایی پرایمرها در بهترین غلظت، با استفاده از رقت‌های مختلف پرایمرها، RT-qPCR با سه تکرار برای هر کدام از رقت‌های تهیه‌شده انجام شد (شکل 3-17) و رقت بهینه pM600/600 انتخاب شد. شکل 3-17-تصویر مربوط به انتخاب غلظت بهترین پرایمر Ang 3-1-4-8-2-نمودار نتایج الکوی بیان ژن در نمونه¬های تیمارشده و کنترل در این مرحله، میزان بیان ژن¬های VEGFa، Ang، Col1و Col3 در بافت¬های کنترل و درمان به روشRT-PCR بررسی شد. در بررسی الگوی بیان این ژن¬ها درگروه¬های آزمایشی و کنترل (درمان روتین) مشاهده شد که میزان بیان نیمه¬کمی تمامی ژن¬های ذکرشده، به¬خصوص در روز 28 در گروه¬های آزمایشی، افزایش معنی¬داری (05/0 ≥ p ) نسبت به گروه کنترل نشان می¬دهد و همینطور میزان بیان هیچکدام ازژن¬ها درگروه کنترل درهیچ¬یک از روزهای 7، 14، 21 و 28 نسبت به گروه¬های آزمایشی افزایش معنی¬داری را نشان نداد. نمودار الگوی بیان این ژن¬ها با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 7 و به روش one-way ANOVA ترسیم شد. شکل 3-18-الگوی میزان بیان ژن VEGFa در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-19-الگوی میزان بیان ژن Ang در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-20-الگوی میزان بیان ژن Col1 در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)* شکل3-21-الگوی میزان بیان ژن Col3 در گروه¬های مختلف تیمار و کنترل (درمان روتین) در روزهای 7، 14، 21، 28-(p ≤ 0/05)*

فایل های پژوهش