چکیده پژوهش
زمینه و سابقه ویروسهای آنفلوانزا متعلق به خانوادهی ارتومیکسوویریده هستند (4). اختلافات آنتیژنی موجود در پروتئین ماتریکس 1 (M1) و نوکلئوپروتئین (NP) موجب تقسیمبندی این ویروس به سه تیپ A، B و C میشود. ویروس آنفلوانزا A مسئول شیوع اکثر پاندمیها و بسیاری از اپیدمیهای سالیانه بیماری آنفلوانزا است. آنفلوانزا C از تیپهای A و B متفاوت است و بهطورکلی باعث ایجاد بیماریهای خفیف در انسان میشود. ویروس آنفلوانزا A میتواند پرندگان و پستانداران را آلوده کند، درحالیکه ویروسهای آنفلوانزا B و C بهطورمعمول تنها در انسان یافت میشوند. مخزن اصلی و اولیه همه ویروسهای آنفلوانزا، پرندگان وحشی و آبزی هستند. ویروس آنفلوانزاA توسط تغییرات آنتیژنیک دو گلیکوپروتئین سطحی هماگلوتینین ((HA و نورآمینیداز ( (N به زیر تیپهایی تقسیم میشود. در حال حاضر 18 زیرتیپ HA (H18-H1) و 11 زیرتیپ از NA (N11-N1) وجود دارد. برخلاف آنفلوانزا A، آنفلوانزا B و C دارای زیرتیپ نیستند(5). مورفولوژی و ساختار ژنتیکی ویروس آنفلوانزا A ذرات ویروس آنفلوانزا معمولاً کروی هستند و حدود 80-120 نانومتر قطر دارند (6). ویروس آنفلوانزا A از ویروسهای پوششدار است و دارای ژنوم RNA ی تکرشتهای با پلاریته منفی است که بهصورت هشت قطعه مجزا مشاهده میشود (6, 7). ژنوم هشت قطعهای ویروس آنفلوانزا A نه پروتئین را کد میکند. اولین سه قطعه ژن (PB2، PB1 و PA)، پروتئینهایی را کد میکنند که نقش پلیمرازی را ایفا میکنند. دو قطعه ژنی بعدی هماگلوتینین و نورآمینیداز هستند که گلیکوپروتئینهای سطحی را کد میکنند. هماگلوتینین و نورآمینیداز در پوشش ویروس جای میگیرند (8) و بهصورت میلههایی با طول 10 نانومتر روی سطح ذره ظاهر میشوند (9). ویروس با کمک هماگلوتینین میتواند به گیرندههای سطح سلول متصل و سپس به سلولهای میزبان وارد شود. نورآمینیداز نیز باعث جوانه زدن ویریونهای جدید از سلولهای عفونی میشود (8). تک قطعه ژنی بعدی، نوکلئوپروتئین را کد میکند که مسئول اتصال به RNA ویروسی است (8) و یک ریبونوکلئوپروتئین (RNP) به قطر 9 نانومتر را شکل میدهد. ریبونوکلئوپروتئین ساختار مارپیچی به خود میگیرد و نوکلئوکپسید ویروسی را شکل میدهد و سه پروتئین بزرگ (PB1، PB2 و PA) نیز به ریبونوکلئوپروتئین متصل میشوند (9). هفتمین قطعه ژنی، دو پروتئین به نامهای پروتئین ماتریکس 1 و پروتئین ماتریکس 2 ((M2 را کد میکند. پروتئین ماتریکس 1 پروتئین کپسید ویروسی است و پروتئین ماتریکس 2 یک پروتئین غشایی است که بهعنوان کانال یونی نقش دارد. آخرین قطعه، دو پروتئین غیر ساختاری 1 (NS1) و غیر ساختاری 2 NS2)) را کد میکند (8). تغییرات آنتیژنی ویروس آنفلوانزا دو آنتیژن سطحی هماگلوتینین و نورآمینیداز بهصورت مستقل از یکدیگر دستخوش تغییرات آنتیژنی قرار میگیرند. تغییرات آنتیژن کمتر و کوچکتر بهاصطلاح دریفت آنتیژنی نامیده میشوند و تغییرات آنتیژنی اصلی در این آنتیژنها شیفت آنتیژنی نامیده میشوند که باعث ظهور یکسویه جدید میگردند. شیفت آنتیژنی نقش مهمتری در ایجاد یک اپیدمی دارد. دریفت آنتیژنی ناشی از انباشتگی موتاسیونهای نقطهای در یک ژن میباشد که موجب تغییر آمینواسید در یک پروتئین میشود. شیفت آنتیژنی تغییرات بزرگی را در توالی یک پروتئین سطحی ویروس ایجاد میکند، تغییراتی که بزرگتر از آن است که توسط موتاسیون ایجادشده باشد. ژنوم قطعهقطعه ویروسهای آنفلوانزا در سلولهایی که آلودگی دوتایی دارند، بازآرایی میشوند. مکانیسم این شیفت آنتیژنی، بازآرایی ژنتیکی بین ویروسهای آنفلوانزای انسانی و پرنده است. ویروسهای آنفلوانزا B و C دارای شیفت آنتیژنی نیستند، زیرا ویروسهای مرتبط کمی، با این ویروسها در جانوران وجود دارند (9). عوارض ویروس آنفلوانزا در انسان بهطورمعمول، ویروسهای آنفلوانزا باعث ایجاد عفونتهای حاد میشوند. علائم آنفلوانزا کلاسیک (عوارض خفیف) معمولاً بهصورت شیبدار ظاهر میشود و در افراد بالغ و نوجوان معمولاً با شروعی سریع و ناگهانی (حدود 24 تا 48 ساعت بعد از آلودگی)، تب بالا (40-38 درجه سانتیگراد)، لرز، درد عضله، سرفه خشک، گلودرد، سردرد، بیقراری، بیاشتهایی و نقص درراههای هوایی کوچک همراه است. میزان تب در 24 ساعت اول عفونت در بیشترین حالت است و میتواند بین یک تا پنج روز در طول زمانی که ذرات عفونی ویروس فعالانه پخش میشود طول بکشد. در کودکان علائم مشابه بالغین است، اگرچه ممکن است علائم گوارشی ازجمله حالت تهوع، استفراغ، درد شکم و اسهال نیز مشاهده شود (10, 11). تخمین زدهشده که بیماریهای فصلی آنفلوانزا، سالیانه 3 تا 5 میلیون مورد بیماری شدید و وخیم ایجاد میکنند و موجب 250 تا 500 هزار مورد مرگ در کل دنیا میگردند (4, 12). شایعترین عوارض جدی آنفلوانزا در ریه رخ میدهد و به سه دسته اصلی، پنومونی ویروسی اولیه، پنومونی باکتریایی ثانویه و تشدید بیماریهای مزمن تقسیم میشود. پنومونی آنفلوانزا برای اولین بار در پاندمی 1958-1959 H2N2)) شناخته شد (13) و با میزان بالایی از مرگومیر همراه بود (20-6 درصد) (14, 15). پنومونی ویروسی میتواند 24 ساعت بعد از شروع بیماری همراه با تب آغاز و با تودههای پراکنده، سیانوز و درنهایت نارسایی تنفسی مشخص میشود (16, 17). متأسفانه بیماران اغلب باوجود درمان ضدویروسی، بدتر میشوند. یافتههای هیستوپاتولوژیک در پنومونی ویروسی خالص شامل برونشیت نکروزه، خونریزی درون آلوئول، ادم ریوی و سندرم درد تنفسی حاد (ARDS) است که اغلب نیز کشنده است (18). پنومونی باکتریایی ثانویه اولین بار در طی پاندمی 1918 (H1N1) شناسایی شد و با تب مجدد، تنگی نفس و سرفه در فاز مقدماتی عفونت مشخص میگردد (19). استافیلوکوکوس اورئوس، هموفیلوس آنفلوانزا و استرپتوکوکوس پنومونیه از پاتوژنهایی هستند که با پنومونی ثانویه باکتریایی همراه هستند (20). پنومونی ثانویه باکتریایی میتواند با میزان مرگومیر بالایی در حدود 33 درصد همراه باشد و طی پاندمی و اپیدمیهای فصلی مشاهدهشده است. عفونتهای آنفلوانزا موجب وخیمتر شدن بیماریهای مزمن ریوی ازجمله بیماری مزمن انسدادی ریه (COPD) و سیستیک فیبروزیس که از قبل وجود داشتهاند و همچنین افزایش مرگومیر میشوند. مکانیسمهایی که این فرآیند را پایهگذاری میکنند هنوز بهخوبی شناختهنشدهاند. سندرم درد تنفسی حاد با خونریزی آلوئولی مشخص و با رخنه کردن سلولهای تکهستهای در ریه همراه است و اغلب نیز کشنده است (21, 22). در موارد خیلی شدید بیماری، لمفوپنی و نقص در چندین ارگان ازجمله قلب و کلیه نیز ممکن است رخ دهد (23, 24). شواهد محدودی وجود دارد که نشان میدهد ویروسهای با توان بیماریزایی بالا، به دلیل عدم تنظیم و کنترل پاسخ ایمنی در اندامهای غیرتنفسی تکثیر و موجب نقص در چندین ارگان میشوند. علاوه بر این، در پاندمی سال 1918، میزان مرگومیر ناخوشایندی در بین بزرگسالان سالم 15 تا 34 سال وجود داشت که منعکسکننده نقش سیستم ایمنی در آسیبهای به وجود آمده است (25). در عفونتهای کشنده آنفلوانزا مرغی H5N1 نیز نقش سیستم ایمنی در آسیبهای به وجود آمده مشاهدهشده است (26). یکی دیگر از تظاهرات برجسته و شدید دیدهشده، واکنش هموفاگوسیتوزیس است (21, 23, 27). این اختلال درواقع نقصی در سیستم فاگوسیتیک تکهستهای است که مشخصه آن تکثیر هیستوسیتها و فاگوسیتوز گسترده اریتروسیتها، لکوسیتها، پلاکتها و پیش سازهای آنها توسط ماکروفاژهای فعال است (28, 29). این پروفایل آسیبشناسی که با نقص در چندین ارگان همراه بوده است در چندین مورد بیماری شدید ازجمله پاندمی 1918 و آلودگی با آنفلوانزا مرغی H5N1 مشاهدهشده است (22, 23, 27). سندرم هموفاگوسیتیک ، درواقع به دلیل میزان بالایی از سایتوکاینهای فعالکننده ازجمله فاکتور نکروزدهنده-آلفا TNFα)) و اینترلوکین 6 (IL6) ایجاد میشود و با پیشآگهی پایینی نیز همراه است (29, 30). از این گذشته التهابی که بهواسطه سایتوکاینها یعنی TNFα و IL6 ایجاد میشود به پاتوژنز بیماری مربوط است. اگرچه آنها از اجزای مهم در محدود کردن بیماری هستند، بااینحال این سایتوکاینها عمدتاً موجب علائم سیستمیک مانند تب، درد عضله و بیاشتهایی میشوند (21, 27, 31-34) و همچنین با شدت علائم بیماری نیز مرتبط هستند (34). درواقع TNFα و IL6 از سایتوکاینهای پیش التهابی هستند و التهاب منجر به افزایش استرساکسیداتیو، آپوپتوز، نکروز، چسبندگی و مهاجرت سلولهای ایمنی به ریه میشود. این فرآیندها نیز منجر به آزاد شدن دیگر واسطههای التهابی ازجمله سایتوکاینهای پیش التهابی و به دنبال آن افزایش آسیبدیدگی ریه میشوند. مطالعات قبلی نشان دادهاند، عوارض آنفلوانزای شدید و نهایتاً مرگی که در اثر این بیماری ایجاد میشود، علاوه بر تکثیر ویروس به دلیل تولید بیشازاندازهی سایتوکاینهای پیش التهابی است که توسط ویروس القا میشود (35). پاسخ سیستم ایمنی به آنفلوانزا و نقش سایتوکاینهای پیش التهابی اولین هدف ویروس آنفلوانزا سلولهای اپیتلیال پوشاننده راههای هوایی و سپس سلولهای اپیتلیال آلوئولار هستند. سلولهای اپیتلیال پوشاننده راههای هوایی میتوانند بیشترین میزان ویروس را تولید کنند و به دنبال آن ماکروفاژهای آلوئولار بیشتری را نیز آلوده کنند (36). پس از عفونت، سلولها با تولید سایتوکاین و کموکاینها به ویروس پاسخ داده (36-38) و نهایتاً دستخوش نکروز یا آپوپتوز قرار میگیرند (39, 40). این سایتوکاینها تحت عنوان سایتوکاینهای اولیه نامیده میشوند و توسط سلولهای غیر ایمنی موجود در محل عفونت یعنی سلولهای اپیتلیال تولید میشوند و مسئول واکنشهای التهابی موضعی و همچنین اثرات سیستمیک هستند. سایتوکاینهای اولیه شامل TNFα، اینترلوکین 1 (IL1)، اینترفرون آلفا (IFNα)، اینترفرون گاما (IFNγ)،IL6، سایتوکاینهای جاذب شیمیایی نوتروفیل یعنی اینترلوکین8 ((IL8، پروتئینهای التهابی ماکروفاژ (MIPs) و پروتئینهای جذبکننده منوسیت (MCPs) هستند. TNFα یکی از سایتوکاینهای پیش التهابی مهم است که نقش مهمی در ایجاد التهاب و آسیب ریوی طی عفونت آنفلوانزا ایفا میکند. درواقع این سایتوکاین از طریق رسپتورهایTNF-R1 و TNF-R2 به سلولها متصل و چندین مسیر سیگنالینگ را در سلولها فعال میکند. یکی از این مسیرها، مسیر فاکتور هستهای کاپا B (NFκB) است. این مسیر نقش مهمی را در افزایش بیان ژنهای التهابی نظیر TNFα و IL6 ایفا میکند. TNFα همچنین تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) را تحریک میکند. ROS، لیگاندهای اندوژنوس هستند که در طول آسیب بافتی تولیدشده و دیگر عامل فعال شدن مسیرNFκB و به عبارتی تولید سایتوکاینهای پیش التهابی، ایجاد التهاب و آسیب ریوی هستند (35). TNFα با اثر در بیان مولکولهای چسبان روی اندوتلیال عروق، اولین قدم را در مهاجرت دو سلول التهابی نوتروفیل و ماکروفاژ به مجاری تنفسی ایفا میکند و این دو سلول نیز از طریق سیگنالهای دقیق کموکاین و با کمک مولکولهای چسبان بیانشده مستقیماً به ریه مهاجرت کرده (41) و با ترشح بیشتر سایتوکاینهای TNFα و IL6 و موجب تقویت طوفان سایتوکاینی و آسیب ریه میشوند (42). IL6 نیز دیگر سایتوکاین پیش التهابی است که مانند TNFα از سایتوکاینهای چند عملکردی است (42). همچنین، این دو سایتوکاین از شستشوی نازوفارنکس و سرم افرادی که درگیر آنفلوانزای شدید بودند، جداشدهاند (34). درواقع RNA تکرشتهای ویروس توسط گیرندههای ایمنی ذاتی ازجملهTLR7 ،RLRs شناسایی و موجب فعال شدن فاکتور نسخهبرداری NFκB در سلولهای اپیتلیال میشود. این فاکتور نیز موجب بیان ژن سایتوکاینهای پیش التهابی ازجمله TNF-α، IL6 و IL1 میشود (43, 44). گیرندههای ایمنی ذاتی RLRs وTLR7 علاوه بر سلولهای اپیتلیال در سلولهای آلوئولار، سلولهای دندریتیک مقیم ریه، ماکروفاژها، سلولهای کشنده طبیعی ((NK و نوتروفیلها وجود دارند و باعث فعال شدن این سلولها و تولید سایتوکاینهای پیش التهابی میشوند. رهایی این سایتوکاینها در فاز اولیه عفونت، ظرفیت ضدویروسی سلولهای آلوده را بالابرده و موجب فراخوانی سلولهای التهابی از خون (سلول کشنده طبیعی، نوتروفیل و ماکروفاژ) و حتی بخشهای دورتر مانند مغز استخوان به ریه میشوند و این سلولها نیز با تولید بیشتر سایتوکاینها و کموکاینها موجب تقویت طوفان سایتوکاینی میشوند (45-47). بااینحال مشخصشده NK (48)، نوتروفیلها و ماکروفاژها (25) در کنترل تکثیر ویروس نقش مهمی ایفا میکنند. برای مثال نوتروفیلها باوجود آسیبهایی که بهواسطه ترشح سایتوکاینهای پیش التهابی به بافت ریه طی عفونت آنفلوانزا وارد میکنند، میتوانند نقش تنظیمی مهمی نیز طی عفونت ایفا نمایند. بهطوریکه در مطالعهای با حذف نوتروفیل در موشها، التهاب ریوی، ادم و خونریزی افزایش یافت که بیانگر نقش تنظیمی نوتروفیلها است، اگرچه مکانیسم دقیق هنوز مشخص نیست (25, 49). سلولهای کشنده طبیعی نیز با گیرندههای خود سلولهای عفونی را شناسایی و به آنها متصل میشوند. به دنبال اتصال این سلولها، محتویات گرانولهایشان آزادشده و موجب آپوپتوز سلولهای عفونی میشوند (23, 50). ایمنی ذاتی علاوه بر کنترل و کاهش تکثیر ویروس در روزهای اولیه عفونت، موجب تنظیم تکامل ایمنی اکتسابی نیز میشود که بقا سلولی تنها با این نوع پاسخ رخ میدهد و جهت پاکسازی کامل ویروس ضروری است (51, 52). سلولهای ایمنی ذاتی ازجمله: سلولهای دندریتیک پلاسماسیتوئیدpDC) )، سلولهای دندریتیک مشتقشده از منوسیت، ماکروفاژهای آلوئولار و سلولهای دندریتیک بینابینی بعد از فعال شدن نقش مهمی را در عرضه آنتیژن به سلولهای ایمنی اکتسابی موجود در گرههای لنفاوی ناحیهای ایفا میکنند (53, 54). سلولهای دندریتیک مقیم در ریه از طریق فاگوسیتوز سلولهای اپیتلیال مرده (55) و یا عفونت مستقیم (56)، فعالشده و به خارج از ریه مهاجرت میکنند. سایتوکاینهایی مانند اینترلوکین 12 (IL12) و TNF-α نیز به بلوغ و مهاجرت سلولهای دندریتیک کمک میکنند (54, 57). بعد از مهاجرت سلولهای عرضهکننده آنتیژن ((APC بالغ و حمل آنتیژن به گرههای لنفاوی، این سلولها با سلولهای لنفوسیتT بکر که اختصاصی آنتیژن هستند برخورد میکنند. این برخورد باعث میشود این سلولها فعال و تکثیر شوند و به لنفوسیتهای T افکتور تمایز یابند و به سمت ریه مهاجرت نمایند. تعداد این سلولها 8-7 روز بعد از عفونت به بیشترین مقدار میرسد (58). در ریه لنفوسیتهای T کشنده ((CTL فعال با کمک سلولهای T کمککننده ((Th cells، مکانیسمهای سینرژیسم ازجمله ترشح سایتوکاینها مانند اینترفرون گاما، مولکولهای گرانزیم و پرفورین و بیان لیگاندهای مرگ سلولی مانند Fas-L و TRAIL بهطور مستقیم سلولهای آلوده به ویروس را پاکسازی میکنند (59-61). یکی دیگر از نقشهای حیاتی سلولهای T کمککننده علاوه بر کمک به لنفوسیتهای T کشنده، تولید سلولهای B خاطره با طول عمر بالا و پاسخهای آنتیبادی جهت پاکسازی سریع و مؤثر ویروس طی عفونت ثانویه است (62-64). تعداد کمی از سلولهای اختصاصی آنتیژن به سلولهای خاطره با طول عمر بالا تبدیل میشوند. سلولهای T خاطره با کمک دو روش زیر به عفونت ثانویه پاسخ میدهند و بهاینترتیب اثر عمیق محافظتی در برابر ویروس از خود نشان میدهند. کمک لنفوسیتهای T برای تولید آنتیبادی زیرمجموعه اختصاصی سلولهای T کمککننده فولیکولار (Tfh) برای شکلگیری مراکز زایگر و تولید سلولهای B خاطره با طول عمر بالا موردنیاز است (65, 66). سلولهای T کمککننده فولیکولار در حفظ و تکثیر سلولهای B موجود در مراکز زایگر و همچنین برای تمایز این سلولها به پلاسماسل ها و سلولهای B خاطره موردنیاز هستند. مطالعاتی که در حیوانات و اخیراً در انسان انجامشده نشاندهنده این است که القای سلولهای T کمککننده فولیکولار از طریق واکسیناسیون با افزایش تولید آنتیبادی همراه است (67, 68). تولید سلولهای B خاطره با طول عمر بالا برای جلوگیری از عفونت مجدد بسیار حیاتی است و همچنین هدف اکثر استراتژیهای فعلی واکسیناسیون است (69). کنترل مستقیم تکثیر ویروس علاوه بر ارائه "کمک" برای تولید آنتیبادی، سلولهای T خاطره در کنترل مستقیم تکثیر ویروس نقش حیاتی دارند. سلولهای T خاطره کشنده و کمککننده اختصاصی آنتیژن در صورت عفونت ثانویه، طی 2-3 روز به محل عفونت آمده و میتواند بهسرعت سایتوکاینهای افکتور را بر اساس شناسایی آنتیژن تولید کنند (70, 71). تولید اولیه سایتوکاین و کموکاینها میتواند موجب بسیج و فعال شدن سلولهای ذاتی و به دنبال آن کنترل تکثیر ویروس شود (72, 73). سلولهای B با جذب مستقیم آنتیژن و یا با سلولهای دندریتیک عرضهکننده آنتیژن فعالشده و با خروج از گرههای لنفاوی در محیط عفونت پاسخ میدهند (74-76). در موش، سلولهای تولیدکننده آنتیبادی سه روز بعد از عفونت در گرههای لنفاوی ناحیهای میتوانند شناسایی و به دنبال آن آنتیبادیهای خنثیکننده در شستوشو بینی و ریه نیز مشاهده میشوند. آنتیبادیهای خنثیکننده که بهطور مستقیم در برابر سر کروی هماگلوتینین سطحی هستند، بهعنوان مؤثرترین واسطههای حفاظتی در برابر آنفلوانزا محسوب میشوند و بهطور گستردهای بهعنوان ابتداییترین ارتباط ایمنی در برابر حفاظت از عفونت مجدد در انسانها مورداستفاده قرار میگیرند (77). بااینوجود، به خاطر ماهیت متغیر سر کروی هماگلوتینین، آنتیبادیهای ضد این آنتیژن سطحی، صرفاً اختصاصی سویه میباشند (78). تنظیم پاسخ ایمنی به آنفلوانزا پاسخ ایمنی مؤثر در کنترل ویروس و جلوگیری از صدمات ریوی که بهواسطه ویروس ایجاد میشود ضروری است. بااینوجود تنظیم و کنترل پاسخ ایمنی نیز به دلیل آسیبهایی که این سیستم در میزبان ایجاد میکند، بسیار حیاتی است. مطالعات بر روی حیوانات و همچنین انسان مشخص کرده که پاسخ ایمنی میزبان میتواند موجب ایجاد آسیب ریوی طی عفونتهای فصلی و همچنین پاندمیهای آنفلوانزا شود. مطالعات تجربی در موش و پریماتها بهغیراز انسان، بیان بیشازاندازه سایتوکاین و کموکاینها را بعد از عفونت با سویههای بسیار بیماریزای آنفلوانزا به اثبات رساندهاند (79). بهطور مشابه، افرادی که طی عفونت با ویروس بسیار بیماریزای H5N1 یا طی عفونت شدید فصلی به بیماری مبتلا شدند، سطح بسیار بالایی از حد واسطهای پیش التهابی مانند IL6 را داشتند (23, 33, 80). این پدیده بهعنوان "طوفان سایتوکاینی" نامیده شده است (81, 82). تولید کنترل نشده این سایتوکاینها باعث افزایش جذب سلولهای مونوسیت، ماکروفاژ و NK به ریه میشود، بهاینترتیب سایتوکاینهای بیشتری رها و درنتیجه طوفان سایتوکاینی تشدید میشود (83, 84). اعتقاد بر این است که پاسخ پیش التهابی بیشازاندازه در تولید سایتوکاینهای پیش التهابی در موارد آنفلوانزای شدید باعث ایجاد سندرم درد تنفسی حاد، نقص در چندین ارگان و نهایتاً مرگومیر میشود (21, 85)؛ بنابراین، تنظیم پاسخ ایمنی ذکرشده در بالا برای کاهش ایمونوپاتولوژی و همچنین کاهش سلولهای ایمنی ذاتی که به این فرآیند کمک میکنند، حیاتی است. راهکارهایی نیز برای کاهش التهاب و تنظیم سیستم ایمنی تصور میشود. سلولهای اپیتلیال ریه، مولکول CD200 را جهت کاهش التهاب ریه و مهار ماکروفاژها بیان میکنند (86). تصور بر این است که ماکروفاژ کلاسیک فعال با ترشح سطح بالایی از سایتوکاینهای پیش التهابی (82, 83) نظیر TNFα و IL6 نقش مهمی را در آسیب به ریه ایفا میکند (35). بااینحال، دو جمعیت دیگر ماکروفاژها، یعنی ماکروفاژهای مربوط به ترمیم زخم و ماکروفاژهای نظارتی که هر دو بهعنوان ماکروفاژهای آلترناتیو فعال شناخته میشوند (87)، با کمک رسپتور PPAR-γ که یک تنظیمکننده مهم فنوتیپ آلترناتیو فعال است (88) التهاب ریه را در عفونت کشنده آنفلوانزا کاهش میدهند، همین امر نشان میدهد که ماکروفاژهای آلترناتیو فعال ممکن است در رفع التهاب نقش داشته باشند (89, 90). بااینحال مطالعات بیشتری جهت درک چگونگی کنترل آسیب بافتی توسط ماکروفاژهای فعال آلترناتیو طی عفونت آنفلوانزا لازم است (91). تحقیقات جدید نشان میدهد که سلولهای لنفوئیدی ذاتی (ILC) نقش مهمی را درترمیم آسیب بافتی ایفا میکنند (92). سلولهای لنفوئیدی ذاتی را میتوان به 3 دسته تقسیم کرد: سلولهای NK، سلولهای لنفوئیدی ذاتی RORγt + و سلولهای لنفوئیدی ذاتی نوع 2 ((ILC2. سلولهای NK که بیانکننده اینترلوکین 22 IL22) ) (93) هستند و همچنین سلولهای لنفوئیدی ذاتی نوع 2 که موجب تولید سایتوکینهای سلول T کمککننده تیپ 2 (Th2) شامل اینترلوکین 4 (IL4) ، اینترلوکین 5 ((IL5 و اینترلوکین 13 ((IL13 میشوند (94)، در تنظیم یکپارچگی اپیتلیال و ارتقاء هوموستاز بافت پس از عفونت با آنفلوانزا اهمیت دارند. نقش این سلولها در مشاهدات مشابه در بافتهای مخاطی (95, 96) و همچنین در مدلهای غیر عفونی آسیبدیده نیز مشاهدهشده است (97). این دادهها نشان میدهد که این سلولها میتوانند مکانیزم حفظشدهای برای ارتقاء یکپارچگی بریرهای مخاطی باشند. گرچه به مطالعات بیشتری نیاز است. سایتوکاین ضدالتهابی اینترلوکین 10 (IL10) ، یکی از تنظیمکنندههای منفی و قوی سیستم ایمنی بدن است. این سایتوکاین توسط انواع مختلف سلولی ازجمله ماکروفاژها، نوتروفیلها، سلولهای اپیتلیال، سلولهای B و مهمتر از همه سلولهای T بیان میشود (91). تصور بر این است که IL10 عملکرد و فعالسازی سلولهای عرضهکننده آنتیژن را مهار میکند، بنابراین در کنترل آسیب بافتی طی بیماریهای عفونی و خود ایمنی، نقش حیاتی ایفا میکند، ولی نقش آن در عفونتهای آنفلوانزا در انسان یا مدلهای حیوانی کمرنگ است. تا حدودی غیرمنتظره است، چندین مطالعه اخیر نشان میدهند که بیان اینترلوکین 10 با شدت بیماری و عوارض شدید عفونت آنفلوانزا در انسان ارتباط دارد (98-100). باوجود مکانیسمهای مهاری یا ترمیمی ذکرشده، ویروس آنفلوانزا A میتواند بهواسطه تولید بیشازاندازه سایتوکاینها موجب عوارض شدید نظیر سندرم درد تنفسی حاد و نهایتاً مرگ شود؛ بنابراین هدف قرار دادن مسیرهای التهابی یک فرصت مناسب جهت کاهش آسیبهای بافتی و مرگومیر است (101). درمان واکسیناسیون علیرغم اینکه یک روش مؤثر برای جلوگیری از ویروس آنفلوانزا شناختهشده است (102)، به دلیل تغییرات شیفت و دریفت در پروتئینهای سطحی آنفلوانزا سالیانه باید بهروز شود تا اثرات مؤثر خود را به سویههای جدید نشان دهند (102, 103). داروهای مورداستفاده در بیماران جهت درمان به دودسته مهارکنندههای نورآمینیداز نظیر اسلتامیویر و زانامیویر و مهارکنندههای کانالهای یونی پروتئین ماتریکس 2 نظیر ریمانتادین و آمانتادین تقسیم میشوند و در حال حاضر جهت درمان استفاده میشوند (104) که علاوه بر مقاومت دارویی (101)، صرفاً ضد پروتئینهای ویروسی هستند و مکانیسمهایی که منجر به تولید بیشازاندازه سایتوکاینهای پیش التهابی TNFα وIL6 میشوند را هدفگیری نمیکنند (104)؛ بنابراین به ترکیب جدیدی جهت کنترل پاسخ ایمنی در تولید سایتوکاینهای پیش التهابی با عوارض کمنیاز است که به توان در زمان مناسب و به هنگام شیوع سویههای نو در کنار داروهای ضدویروسی جدید از آن استفاده شود (109). چای سبز چای سبز با نام علمی Camellia sinensis از خانواده Theaceae بوده که گیاهی است بوتهای و دارای برگهای سبز و چرمی، گلهای سفید و معطر میباشد. پودر چای سبز که حاصل فرایند خشککردن و خرد کردن برگهای تازه گیاه است؛ بدون عبور از مرحله اکسیداسیون و تخمیر حاصل میشود. چای سبز از حدود 3000 سال قبل از میلاد مسیح، در آسیای شرقی بهمنظور ارتقای سلامت و افزایش طول عمر مورد مصرف بوده است. گیاه چای سبز محصولی است که در آسیا به فراوانی یافت میشود و یکی از رایجترین نوشیدنیها در میان مردم جهان است چای سبز دارای اثرات آنتی باکتریال، ضدالتهاب و نیز خاصیت آنتیاکسیدانی بالا میباشد که عمده این خواص به دلیل وجود ترکیبات پلی فنولیک بهخصوص ترکیبات کاتچین در برگهای چای سبز است(105, 106). اپیکاتچین، اپیکاتچینگالات، اپیگالوکاتچین، اپیگالوکاتچین گالات از ترکیبات اصلی موجود در چای سبز میباشند که دارای خاصیت آنتیاکسیدانی هستند. در این میان خاصیت آنتیاکسیدانی اپی گالو کاتچین گالات 25-100 مرتبه از ویتامینهای E,C قویتر است (107, 108). از دیگر ترکیبات چای سبز میتوان به تئوفیلین، ویتامینهای B1 و B2 و C و E، ال تیانین، تانین، اسیدهای اگزالیک و گالیک، پکتین، کافئین، فلوراید، مواد معدنی اشاره نمود(109). امروزه مطالعات وسیعی در تائید تأثیر چای سبز در پیشگیری و یا درمان برخی از بیماریها صورت گرفته ازجمله این تحقیقات منتشرشده میتوان به موارد ذیل اشاره نمود. کاهش و تنظیم وزن، درمان التهاب و ناراحتیهای پوستی، التیام زخم،جلوگیری از پیری زودرس پوست،پیشگیری بعضی از سرطانها، کاهش فشارخون، کلسترول و قند خون، درمان امراض قلبی و تنظیم هورمونهایی که درنهایت منجر به تندرستی، سلامت و طول عمر انسان میشوند. طبق آخرین گزارشها موجود، از چای سبز اثرات ضد میکروبی و ضدپوسیدگی دندان نیز گزارششده است. مهمترین فعالیتها شامل خاصیت آنتیاکسیدانی (110, 111)، ضدالتهابی، ضدعفونیکننده، کاهشدهنده چربی، جلوگیری از چسبندگی داخل شکمی بعد از عمل، اثر ضد باکتریایی و حفاظت از آسیب کلیه ناشی از کنتراست میباشد (112-114). فعالیت ضدویروسی عصارههای C.sinensis در برابر ویروسهای تبخال، هپاتیت، آدنوویرس و آنفلوانزا قبلاً در آزمایشها انجامشده است (115). بیان مسئله ویروس آنفلوانزا A موجب پنومونی و عوارض شدیدی نظیر سندرم درد تنفسی حاد میشود که سالیانه به دنبال آن 250 تا 500 هزار نفر در سراسر جهان جان خود را از دست میدهند. تحقیقات قبلی مشخص کردهاند که عوارض شدید و نهایتاً مرگومیری که در اثر این بیماری ایجاد میشود علاوه بر تکثیر ویروس به دلیل پاسخهای شدید ایمنی در تولید بیشازاندازه سایتوکاینهای پیش التهابی علیه این ویروس است. داروهای ضد آنفلوانزایی کنونی صرفاً مکانیسمهایی را که مخصوص رشد و تکثیر پروتئینهای ویروسی است، مهار نموده و تولید بیشازاندازه سایتوکاینهای پیش التهابی را کنترل نمیکنند، همچنین این داروها با مقاومت نسبی و عوارض جانبی نیز همراه هستند. به همین دلیل، به نظر میرسد استفاده از ترکیبات دارویی، بهویژه ترکیبات گیاهی، با خاصیت ضدالتهابی و تعدیلکننده سیستم ایمنی در مورد درمان عفونت ریوی ناشی از این ویروس مفید باشد. چای سبز که از برگ گیاه C.sinensis گرفته میشود دارای ترکیبات متنوعی بهخصوص خانواده کاتشینها میباشد که در مطالعات مختلف اثرات آنتیاکسیدنی، ضدالتهابی، ضدویروسی، ضدعفونیکننده و اثر ضد باکتریایی این گیاه نشان دادهشده است. خاصیت ضد ویروسی عصاره چای سبز در مطالعات مختلف گزارش شده واثر بخشی آن بر مهار تکثیر ویروس آنفلوانزا نداریم. ولی در مورد تأثیر آن در کنترل فاکتورهای پیش التهابی تشدیدکننده عفونت ریوی با ویروس آنفلوانزا اطلاعات چندانی در دست نیست. لذا در این مطالعه اثر عصاره چای سبز بر کنترل سایتوکاینهای پیش التهابی IL-1 و IL-6 و نیز بر تکثیر ویروس آنفلوانزا A (H1N1) پس از عفونت در سلولهای Madin-Darby Canine Kidney cells موردمطالعه قرار گرفت.. روش اجرا نوع مطالعه و حجم نمونه این مطالعه تجربی با هدف کلی بررسی اثر عصاره چای سبز بر کنترل سایتوکاینهای پیش التهابی IL-1 و IL-6 و نیز بر تکثیر ویروس آنفلوانزا A (H1N1) در محیط آزمایشگاهی و در آزمایشگاه ویروس شناسی مرکز تحقیقات گیاهان داروئی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد انجام گرفت. کشت و تیمار ویروس ویروس آنفلوانزا H1N1 (A/Puerto Rico/8/34) از بخش آنفلوانزای انستیتو پاستور تهیه و از پاساژهای اولیه ویروس در ویال، استوک تهیه شد و پس از تعیین تیتر ویروس به کمک روش TCID50، ویروس بهعنوان بذر اولیه ویروسی تا انجام آزمایشات بعدی در فریزر 70- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. تست هماگلوتیناسیون ویروسهای آنفلوانزا با توانایی ایجاد آگلوتیناسیون در گلبولهای قرمز مشخص میشوند. فعالیت هماگلوتیناسیون را میتوان با مخلوط کردن رقتهای مختلف ویروس با گلبول قرمز مرغ در میکروپلیت مشاهده کرد. برای انجام این روش، یک رقت سریالی از محیط حاوی ویروس آنفلوانزا تهیه و پس از اضافه کردن گلبول قرمز مرغ (5/%0) بهتمامی چاهکها، به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. معکوس رقت آخرین چاهکی که هماگلوتیناسیون کامل را نشان دهد، معرف تیتر ویروس است. بهعنوانمثال اگر هماگلوتیناسیون کامل در رقت 1:256 رخداده باشد، تیتر HA محلول اولیه حاوی ویروس 256:HA تلقی میشود. بهعبارتدیگر 1:256 از µl 50 ویروس اولیه، حاوی یک واحد HA میباشد. تعیین عیار ویروس به روش TCID50 در این روش ابتدا سلولهای MDCK در میکروپلیتهای 96 چاهکی کشت و پس از تشکیل تکلایه سلولی رقتهای یک لگاریتمی از ویروس به چاهکها اضافه گردید بهطوریکه هر غلظت حداقل 5 تکرار داشت. بعد از نگهداری میکروپلیت در 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت، محیط سطح سلول تخلیه و محیط حاوی محیط رشد ویروس (mg/ml2 تریپسینTPCK و 3/0%BSA ) به چاهکها اضافه گردید. میکروپلیتها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با 5% کربندیاکسید به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. پس از انکوباسیون وجود ویروس در هر چاهک به کمک روش هماگلوتیناسیون بررسی و نتایج حاصل با استفاده از روش Reed and Munch محاسبه گردید (1). بررسی میزان سمیت چای سبز به روش MTT assay جهت بررسی اثر سمیت سلولی عصاره بر سلولهای MDCK (درصد مرگ سلولی) و به دست آوردن غلظت کشنده برای نیمی از سلولها (CC50) بر روی این رده سلولی، آزمون MTT انجام گرفت. بدین منظور سلولهای موجود در فلاسک پس از تریپسینه کردن سانتریفیوژ گردید و سپس با لام نئوبار و رنگآمیزی تریپان بلو شمارش گردید. به هر چاهک از پلیت 96 خانه سوسپانسیون سلولی حاوی 104 سلول در حجم µL 100 اضافه گردید. بعد از 24 ساعت و تشکیل تک لایه سلولی، سلولها با غلظتهای مختلف ترکیب چای سبز به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. پس از انکوباسیون سلولها به همراه چای سبز در زمان موردنظر، محیط رویی سلولها خارج و هر چاهک با µL 100 PBS شستوشو داده شد و سپس MTT (از غلظت mg/ml 5) به نسبت 1 به 5 با PBS رقیق و به هر چاهک µL 60 اضافه گردید و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پس از سپری شدن زمان انکوباسیون، محتویات چاهکها بهآرامی خارج و به آنها µL 100 DMSO اضافه و میکروپلیت به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. جذب نوری پلیتها در nm570 اندازهگیری گردید. تست MTT برای هر غلظت از ترکیب بهصورت سهتایی انجام شد. CC50 یا غلظتی از ترکیب که 50% سلولهای کشت دادهشده را از بین میبرد، بر اساس منحنی دوز پاسخ و استفاده از تست آماری آنالیز رگرسیون و نرمافزار Graphpad prism 6 محاسبه شد. جذب نوری ثبتشده توسط الایزاریدر با استفاده از فرمول زیر به درصد مرگ سلولی تبدیل شد (2). بررسی اثر عصاره چای سبز بر تیتر ویروس جهت بررسی تاثیر عصاره چای سبز برتیتر ویروس پس از تشکیل تک لایه سلولی در میکروپلیت 12خانه، سلول ها دوبار با بافرPBS شسته و ویروس با غلظت 100TCID50 اضافه گردید. پس از یک ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد محیط سطح سلول که حاوی ویروس میباشد، خارج وسلولها با PBS شستشو داده شد.سپس lμ800 محیط کشت حاوی غلظت های مختلف غیر سمی عصاره چای سبز (50، 25، 5/12 و25/6 ) با µg/ml 8/0تریپسین-TCPK به هر چاهک اضافه گردید. میکروپلیت ها در انکوباتور 37 درحه سانتیگراد انکوبه شدند و پس از 48 ساعت محیط رویی میکروپلیت ها جمع آوری و تیتر ویروس هر چاهک با روش هماگلوتیناسیون و روش TCID50 محاسبه و نتایج با کنترل ویروس مقایسه گردید(3). آمادهسازی سلولها جهت بررسی تأثیر چای سبز بر میزان بیان ژنهای سایتوکاینی بهمنظور بررسی اثر چای سبز بر میزان بیان ژنهای سایتوکاینی از روش Real-time، PCR استفاده شد. در این روش ابتدا در میکروپلیتهای 12 خانهای، تکلایه سلولی از سلولهای MDCK تهیه و سپس ویروسی با غلظت TCID50100 به محیط کشت اضافه گردید. بعد از گذشت 1 ساعت محیط حاوی ویروس خارج و محیط کشت حاوی غلظتهای 25/3 و 5/7 و15 و30 میکروگرم/ میلیلیتر چای سبز و mg/ml7/0 تریپسینTPCK به سلول اضافه گردید. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد همانند موارد قبل، محیط رویی سلولها حذف و RNA تام داخل سلولی با استفاده از ترایزول استخراج و پسازاینکه با استفاده از پرایمر اختصاصی (oligo-dT) به cDNA تبدیل شد. کلیه مراحل انجام این فرآیند طبق دستورالعمل کیت یکتا تجهیز آزما (ایران) و بر اساس برنامه دمایی جدول زیر انجام شد. میزان RNA تام داخل سلولی با استفاده از روش PCR Real-time و پرایمر اختصاصی طبق آنچه که توضیح داده خواهد شد اندازهگیری شد. در کلیه آزمایشات PCR Real-time از ژن GAPDH بهعنوان کنترل استفاده شد. جدول شماره1: برنامه سیکلهای بهکاربرده شده برای تهیه cDNA 5 دقیقه 25 درجه سانتیگراد 1 سیکل 60 دقیقه 42 درجه سانتیگراد 1 سیکل 5 دقیقه 70 درجه سانتیگراد 1 سیکل نحوه انجام واکنش real time-PCR میزان بیان ژنهایTNFα،IL6، IL1β با استفاده از کیت Maxima SYBR Green Master Mix (یکتا تجهیز آزما، ایران) و دستگاه Rotor Gene TM 3000 (Corbett، (Australia موردبررسی قرار گرفت. برای انجام real time-PCR ابتدا توالی پرایمرهای موردنظر طراحی گردید. پرایمرها توسط شرکت پیشگامان بهصورت لیوفیلیزه سنتز شد. مشخصات پرایمرها در جدول 3-2 نشان دادهشده است. جدول شماره2: پرایمرهای بهکاررفته برای انجام real time-PCR نام ژنها توالی پرایمرها (5'3') دمای ذوب ((C طول محصول (bp) TNF F:5'TTCTTGCCCAAACCGACCCT-3 R:5'CCAGCCCTGAGCCCTTAATTCT-3' 5/60 64 90 IL6 F:5'GCCCACCAGGAACGAAAGAG-3' R:5'GGAAAGCAGTAGCCATCACCA-3' 5/62 3/61 113 IL1 F:5'GCTGCCAAGACCTGAACCAC-3' R: 5'ACAATGACTGACACGAAATGCCTC -3' 5/62 5/63 158 GAPDH F:5'GGAGAAAGCTGCCAAATATGACGA-3' R:5'CGAAGGTGGAAGAGTGGGTGT-3' 1/61 5/59 140 کلیه مراحل real time-PCR در دستگاه (Corbett) Rotor Gene TM 3000 انجام شد. برنامه زمانی-گرمایی دستگاه در سه مرحله تنظیم گردید. • مرحله اول: 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد بهمنظور واسرشتگی مولکول cDNA • مرحله دوم: شامل 40 سیکل، که در هر سیکل به ترتیب سه مرحله انجام گردید. الف) 15 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد جهت واسرشتگی ب) 20 ثانیه در دمای 61 درجه سانتیگراد جهت جفت شدن ج) 25 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد جهت گسترش • همچنین پس از پایان یافتن سیکلها، منحنی ذوب نمونهها در بازه دمای 73 تا 95 درجه سانتیگراد رسم شد بهطوریکه در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 42 ثانیه و در بقیه دماها به مدت 5 ثانیه پایش انجام شد. منحنی ذوب نمونهها بهمنظور تعیین خلوص محصولات و آگاهی از وجود یا عدم وجود ناخالصی رسم شد. 6) جهت آنالیز کمی و بررسی میزان بیان ژنهای مربوطه با توجه به ماهیت تحقیق که یک بررسی نسبی بیان بین دو گروه میباشد، تجزیهوتحلیل اطلاعات خام حاصل ازreal time-PCR به روش آستانه نسبی یا ΔΔCt انجام شد. برای آنالیز دادهها ابتدا، ΔCT ژن در هر نمونه از افتراق CT ژن مربوطه و CT ژن GAPDH بهعنوان ژن رفرنس محاسبه شد؛ و بعد با نرمافزار Graph pad prism 6 آنالیز شدند. آمادهسازی سلولها جهت بررسی تأثیر چای سبز بر میزان تولید IL6و IL1β بهمنظور بررسی چای سبز اثر بر میزان تولید میزان تولید IL6و IL1β از روش الایزا استفاده شد. در این روش ابتدا در میکروپلیتهای 12 خانهای، تک لایه سلولی از سلولهای MDCK تهیه و سپس ویروسی با غلظت TCID50100 به محیط کشت اضافه گردید. بعد از گذشت 1 ساعت محیط حاوی ویروس خارج و محیط کشت حاوی غلظتهای 5/7، 15 و30 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره چای سبز به سلول اضافه گردید. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، محیط رویی جهت بررسی میزان سایتوکاینها توسط تست الایزا برداشته و تا استفاده بعدی در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد. تعیین مقدار پروتئینهای IL1βو IL6، با استفاده از الایزا الایزا روشی کمی برای سنجش پروتئینهای ترشحشده در سوپرناتانت کشت سلولی است. برای انجام این تست از kit ,IL1β ,IL6 thermo fisher) Canise TNFα, آمریکا) استفاده و با توجه به دستورالعمل کیت عمل شد. روش تجزیهوتحلیل دادهها مقدار CC50 از تست آماری آنالیز رگرسیون و نرمافزار Graph pad prism 6 محاسبه گردید. در آزمایشات real time-PCR دو آزمایش مستقل و برای هر آزمایش دو تکرار و آزمایشات الایزا بهصورت سه آزمایش مستقل انجام شدند و مقادیر بر اساس میانه (median±SD) بیان گردیدند. بررسی آماری و رسم نمودارها به کمک نرمافزارGraphPad Prism 6 Demo انجام گردید. معنیداری آماری اختلافات آزمونهای نا پارامتری با استفاده از تست Kruskal-Wallis بررسی شد. در این مطالعه Pvalue کمتر از 05/0 معنی¬دار در نظر گرفته شد. یافته ها نتایج سمیت سلولی چای سبز سمیت سلولی چای سبز بر سلولهای MDCK 48 ساعت بعد از تیمار با چای سبز با روش MTT بررسی شد.. CC50 ترکیب 53/78 (فاصله اطمینان%95: 67/92-55/66) با نرمافزار Graph pad prism 6 محاسبه گردید. نمودار شماره1: منحنی سمیت سلولی چای سبز (CC50)بر سلولهای MDCK نتایج ناشی از اثر پونیکالاجین بر میزان تولید ذرات ویروسی در این مطالعه اثرپونیکلاجین بر میزان تیتر ویروس با استفاده از روش هماگلوتیناسیون و TCID50 بررسی گردید. بدین منظور، تک لایه سلولی حاوی ویروس با غلظت های مختلف عصاره چای سبز تیمار و پس از24 و48 ساعت محیط رویی چاهک ها جمع آوری شد. تیتر ویروس با استفاده از روش های هماگلوتیناسیون و TCID50 محاسبه گردید. براساس نتایج بدست آمده، عصاره چای سبز باعث کاهش معنی داری در میزان تیتر ویروس در مقایسه با کنترل ویروس شد، که این کاهش تیتر ویروس وابسته به دوز می باشد.(05/0p<، جدول شماره 3 و نمودارهای شماره 2-5) جدول شماره3: مقایسه تیتر ویروس در غلظت های مختلف عصاره چای سبز با استفاده از روش هماگلوتیناسیون نمونه غلظت(µg/ml) تیتر HA بر مبنای Log2درlμ50 محیط 24 ساعت 48 ساعت 50 ***0 **0 عصاره چای سبز 25 **55/0±5/0 *83/±75/1 5/12 26/1±3 4/0±25/4 25/6 67/1±4 1±5 کنترل ویروس 26/1±7 5/0±5/8 P Value 0001/0> 0013/0 *05/0p>،**001/>p،***0001>p نسبت به کنترل ویروس، P Value با استفاده از آزمون ناپارامتری کروسکال والیس محاسبه شده است. نمودار شماره2: مقایسه تیترویروس در غلظت های مختلف عصاره چای سبز با استفاده از روش هماگلوتیناسیون 24 ساعت بعد از تیمار: ***001/0>P، **01/0>P در مقایسه با کنترل ویروس، مقادیر براساس میانگین (mean±SEM) بیان شدهاست. معنیدار بودن نتایج حاصل با استفاده از آزمون ناپارامتری کروسکال والیس بدست آمد. نمودارشماره3: مقایسه تیترویروس در غلظت های مختلف عصاره چای سبز با استفاده از روش هماگلوتیناسیون 48 ساعت پس از تیمار. ** 01/0>P، *05/0>P. مقادیر براساس میانگین (mean±SEM) بیان
شدهاست. معنیدار بودن نتایج حاصل با استفاده از آزمون ناپارامتری کروسکال والیس بدست آمد. نمودارشماره4: مقایسه تیتر ویروس در غلظتهای مختلف چای سبز با استفاده از روشTCID50 24 ساعت پس از تیمار.*05/0>Pدر مقایسه با کنترل ویروس. مقادیر براساس میانگین (mean±SEM) بیان شده است. معنیدار بودن نتایج حاصل با استفاده از آزمون ناپارامتری کروسکال والیس بدست آمد. نمودار شماره5: مقایسه تیتر ویروس در غلظتهای مختلف عصاره چای سبز با استفاده از روشTCID50 48 ساعت پس از تیمار. ** 01/0>P، *05/0>P. مقادیر براساس میانگین (mean±SEM) بیان شدهاست. معنیدار بودن نتایج حاصل با استفاده از آزمون ناپارامتری کروسکال والیس بدست آمد. نتایج بیان ژنهای موردمطالعه پس از تیمار با عصاره چای سبز بیان ژن TNFα میزان بیان ژن TNFα بین سلولهای آلوده به ویروس تیمار شده با عصاره و غیرتیمار به مدت 24 ساعت بررسی شد. نتایج میزان بیان این ژن در گروههای تیمار شده در جدول 4-1 آورده شده است که نشان میدهد میزان بیان این ژن در گروههای تحت تیمار با عصاره چای سبز بهصورت وابسته به دوز کاهشیافته است. همانطور که در نمودار شماره6 نشان دادهشده است، در زمان 24 ساعت ویروس باعث افزایش 17برابری میزان بیان ژن TNFa در مقایسه با کنترل سلول شد (05/0>P ). این در حالی است که تأثیر غلظتهای 25/3 ،7.5 ،15 و30 عصاره چای سبز بر روی سلولهای آلوده به ویروس نشان داد که بیان ژن TNFa به ترتیب در حدود 3، 4/2، 6 و 8 برابر نسبت به کنترل ویروس کاهش داشت (05/0>P ) (نمودار شماره6). نمودارشماره6: تغییرات میزان بیان ژن TNFα در گروههای مورد مطالعه. سلولهای MDCK با ویروس آنفلوانزا آلوده و با غلظتهای مختلف از عصاره چای سبز تیمار شد و بعد از 24 ساعت، RNA تام استخراج و میزان بیان داخل سلولی ژن مربوطه با real time- PCR بررسی شد. * =05/0>P ،** =01/0>P نسبت به کنترل ویروس بر اساس آزمون کروسکال والیس. نتایج بیان ژن IL6 میزان بیان ژن IL6 در سلولهای آلوده به ویروس تیمار شده و غیر تیمار شده با عصاره چای سبز به مدت 24 ساعت بررسی شد. نتایج real time-PCR نشان داد که میزان بیان این ژن در کنترل ویروس نسبت به کنترل سلول افزایش چشمگیری داشته است، اما میزان بیان این ژن در سلولهای عفونی تیمارشده با عصاره چای سبز در مقایسه با کنترل ویروس کاهش چشمگیر و وابسته به دوز داشت که ازلحاظ آماری معنیدار بود (05/0>P ) (نمودار4 شماره7). نمودار شماره 7: تغییرات میزان بیان ژن IL-6 در گروه های مورد مطالعه بعد از 24 ساعت. سلولهای MDCK با ویروس آنفلوانزا آلوده و با غلظتهای مختلف از عصاره چای سبز تیمار شد و بعد از 24 ساعت، RNA تام استخراج و میزان بیان داخل سلولی ژن IL-6 با real time- PCR بررسی شد. * =05/0>P ،** =01/0>P نسبت به کنترل ویروس بر اساس آزمون کروسکال والیس. بیان ژن βIL-1 میزان بیان ژن βIL-1 بین سلولهای آلوده به ویروس تیمار شده و غیر تیمار شده با عصاره چای سبز به مدت 24 ساعت بررسی شد. real time-PCR نشان داد که تیمار سلولهای آلوده به ویروس با غلظتهای مختلف از عصاره چای سبز منجر به کاهش میزان بیان βIL-1 بهصورت وابسته به دوز میشود که این کاهش ازنظر آماری در مقایسه با گروه کنترل ویروس معنیدار بود (05/0P < ) (نمودار شماره8). همانطور که در نمودار نشان دادهشده است، ویروس توانسته منجر به افزایش 3/4 برابری در میزان بیان IL-1 شود که این میزان در گروههای دریافتکننده عصاره چای سبز بهصورت چشمگیر کاهشیافته است (05/0P <). نمودار شماره8: تغییرات میزان بیان ژن βIL-1 نسبت در گروههای مورد مطالعه بعد از 24 ساعت. سلولهای MDCK با ویروس آنفلوانزا آلوده و با غلظتهای مختلف از عصاره چای سبز تیمار شد و بعد از 24 ساعت، RNA تام استخراج و میزان بیان داخل سلولی ژن مربوطه با real time- PCR بررسی شد. * =05/0>P نسبت به کنترل ویروس بر اساس آزمون کروسکال والیس. نتایج غلظت پروتئین IL6 پس از تیمار با عصاره چای سبز میزان غلطت IL6 بین سلولهای آلوده به ویروس تیمار شده و غیر تیمار شده با عصاره چای سبز بررسی شد. الایزا نشان داد، میزان غلظت این پروتئین در کنترل ویروس نسبت به کنترل سلول افزایش چشمگیری داشته است. میزان غلظت این پروتئین در سلولهای عفونی تیمار شده با عصاره چای سبز در مقایسه با کنترل ویروس کاهش داشت (05/0>P )(نمودار شماره 9). نمودار شماره9: اثر عصاره چای سبز بر میزان غلظت پروتئینIL6 در سوپرناتانت سلولهای MDCK بعد از 24 ساعت. سلولهای آلوده به ویروس آنفلوانزا با غلظتهای 5/7، 15 و 30 میکروگرم بر میلیلیتر از عصاره چای سبز تیمار شدند و بعد از گذشت 24 ساعت ، میزان غلظت پروتئین IL6 به کمک روش الایزا بررسی شد. * =05/0>P نسبت به کنترل ویروس بر اساس آزمون کروسکال والیس. نتایج غلطت پروتئین βIL-1 پس از تیمار با عصاره چای سبز میزان غلطت βIL-1 بین سلولهای آلوده به ویروس تیمار شده و غیر تیمار شده با عصاره چای سبز به مدت 24 ساعت بررسی شد. نتایج حاصل از الایزا نشان داد، میزان غلظت این پروتئین در کنترل ویروس نسبت به کنترل سلول افزایش چشمگیری داشته است. همچنین عصاره چای سبز توانسته است منجر به کاهش میزان بیان پروتئین βIL-1 در سلولهای آلوده تیمار شده با این عصاره شود (05/0>P ).(نمودار شماره 10) نمودار شماره 10: اثر عصاره چای سبز بر میزان غلظت پروتئین βIL-1 در سوپرناتانت سلولهای MDCK بعد از 24 ساعت. سلولهای آلوده به ویروس آنفلوانزا با غلظتهای 5/7، 15 و 30 میکروگرم بر میلیلیتر از عصاره چای سبز تیمار شدند و بعد از گذشت 24 ساعت، میزان غلظت پروتئین βIL-1 به کمک روش الایزا بررسی شد . * =05/0>P نسبت به کنترل ویروس بر اساس آزمون کروسکال والیس. بحث و نتیجه گیری ترکیبات طبیعی برای درمانهای بالینی در دهههای اخیر موردتوجه و استفاده قرار گرفتند، چای سبز درارای اثرات خوبی در درمان بیماریهایی از قبیل بیماری های قلبی عروقی، کاهش توده بدنی، بیماری های میکروبی، بیماری های ویروسی و سرطان از خود نشان داده است. مطالعات وسیعی در تائید تأثیر چای سبز در پیشگیری و یا درمان برخی از بیماریها صورت گرفته که عمده این خواص به دلیل وجود ترکیبات پلی فنولیک بهخصوص ترکیبات کاتچین در برگهای چای سبز است(105, 106). اپیکاتچین، اپیکاتچینگالات، اپیگالوکاتچین، اپیگالوکاتچین گالات از ترکیبات اصلی موجود در چای سبز میباشند. در مطالعات مختلف اثرات آنتیاکسیدنی، ضدالتهابی، ضدویروسی، ضدعفونیکننده، اثر ضد باکتریایی و حفاظت از آسیب کلیه ناشی از کنتراست این گیاه نشان دادهشده است (110-114). خاصیت ضد ویروسی و ضد التهابی عصاره چای سبز در مطالعات مختلف گزارش شده ولی در مورد تأثیر آن در کنترل فاکتورهای پیش التهابی تشدیدکننده عفونت ریوی با ویروس آنفلوانزا اطلاعات چندانی در دست نیست. لذا این مطالعه باهدف بررسی اثر ترکیب چای سبز بر میزان بیان ژن هایTNFα وIL1وIL6 و غلظت پروتئینهای التهابی IL1وIL6 ناشی از ویروس آنفلوانزا (H1N1) A در شرایط آزمایشگاهی انجامگرفته است. در این مطالعه اثرعصاره چای سبز بر میزان تیتر ویروس با استفاده از روش های هماگلوتیناسیون و TCID50 در 24و48 ساعت پس از تیمار محاسبه گردید. براساس نتایج بدست آمده، عصاره چای سبز باعث کاهش معنی داری در میزان تیتر ویروس در مقایسه با کنترل ویروس شد، که این کاهش تیتر ویروس وابسته به دوز می باشد. هم راستا با مطالعه ما، در مطالعات مختلفی عصاره چای سبز و کاتچین های مشتق شده از آن باعث کاهش تیتر ویروس در سویه های مختلف ویروس آنفلوانزاشده است(115-117). چای سبز را میتوان بهعنوان یک منبع مهم پلی فنول ها بهویژه فلاوونوییدها در نظر گرفت. مهمترین فلاوونوییدهای چای سبز شامل کاتشینها میباشد. (118). با توجه به نتایج حاصل از مطالعات، کاتشینها دارای اثرات ضدویروسی قوی میباشند که در غلظتهای پایین منجر به مهار تکثیر هرپس ویروس ها میشوند(119, 120). مطالعات بیشتر نشان داد که کاتشین های موجود در چای سبز و بهخصوص EGCG منجر به مهار رشد ویروس در مراحل مختلف از قبیل رشد داخل سلولی ویروس، مهار پروتئاز ویروس و آدنیانین (adenain) در محیط برون تنی میشود (121). در مورد اثرات ضدویروسی EGCG در مطالعه Yamaguchi و همکاران (سال 2001) نشان داده شد که این ترکیب با اثر بر مراحل مختلف چرخه زندگی ویروس HIV-1 میتواند از تکثیر آن جلوگیری کند (122). بر اساس نتایج بهدستآمده ، عصاره چای سبز با یکروند وابسته به دوز باعث کاهش میزان بیان ژن هایTNFα ، IL6 و IL1 و پروتئینهای IL6 و L1 ناشی از ویروس آنفلوانزا A درکشت سلول گردید. مطالعات مختلفی بر روی اثرات ضدویروسی و ضدالتهابی ترکیبات طبیعی و همچنین چای سبز انجامشده است که در ذیل به مواردی اشاره میکنیم. در مطالعه Mehrbod وهمکاران (2012) نشان داده شد که ترکیب طبیعی HESA-A دارای اثر ضدویروسی در سلولهای MDCK میباشند. نتایج این مطالعه نشان داد که HESA-A قادر به افزایش درصد زیست پذیری سلولها تا میزان 31 درصد و کاهش تیتر HA تا 90 درصد در سلولهای مواجه شده با ویروس میباشد. همچنین بر اساس نتایج real Time و الایزا میزان بیان و تولید سایتوکاینهای التهابی مانند TNF-a و IL-6 به میزان چشمگیری در سلولهای آلوده به ویروس کاهش مییابد. همچنین در مطالعه دیگری توسط Zhang وهمکاران اثرات مشابهی در مورد گیاه Chaenomeles speciosa در مورد سلولهای آلوده به ویروس مشاهده شد (123). در این پژوهش، میزان بیان ژن و پروتئین TNFα، IL-6 و IL1 در سلولهای MDCK در اثر آلوده شدن با ویروس آنفلوانزا H1N1; PR8) A) نسبت به کنترل سلول بهطور معنیداری افزایش داشت که با نتیجه مطالعه مهربد و همکارانش که اثر آنفلوانزا H1N1; PR8) A) را بر میزان بیان و تولید سایتوکاینهای پیش التهابی در رده سلولیMDCK موردبررسی قراردادند، همسو میباشد. مجموع نتایج این دو بررسی نشان میدهد که عفونت این ویروس در سلول مذکور باعث افزایش بیان ژن و پروتئین TNFα، IL-6 و IL-1 میگردد؛ اما تیمار سلولهای آلوده به ویروس با غلظتهای مختلف عصاره چای سبز موجب کاهش وابسته به دوز میزان بیان این سایتوکاین نسبت به کنترل ویروس شد (123). هم راستا با این مطالعه در مطالعهای که توسط خلیلی وهمکاران بر روی سلولهای MDCK آلوده به ویروس انجام دادند مشاهده کردند که ویروس منجر به افزایش معنیداری سایتوکاینهای پیش التهابی مانند TNFa و IL-6 میشود که مجاورت سلولهای آلوده به ویروس با غلظتهای مختلف از ترکیب سلاسترول منجر به کاهش معنیدار میزان بیان ژن و همچنین پروتئین سایتوکاینهای پیش التهابی میشود (124) همچنین در مطالعه آقایی و همکاران ویروس آنفلوانزا باعث افزایش معنیداری سایتوکاینهای پیش التهابی مانند TNFa، IL-1β و IL-6 میشود که مجاورت سلولهای آلوده به ویروس با غلظتهای مختلف از ترکیب پونیکالاجین منجر به کاهش معنیدار میزان بیان ژن و همچنین پروتئین سایتوکاینهای پیش التهابی میشود (125). در مطالعه Mota و همکاران اثر ضد التهابی و ضد دردی عصاره چای سبز در مدل حیوانی بررسی و نتایج نشان داد چای سبز دارای خواص ضد درد و ضد التهابی است و می تواند به عنوان یک گزینه درمانی طبیعی در اختلالات التهابی مزمن باشد (126). در مطالعه Reto و همکاران سطوح کاتچین چای سبز و تأثیر آن بر پروفایل لیپیدی انسان و همچنین اثرات محافظتی در برابر آسیب ناشی از H2O2 در فیبروبلاستهای انسانی و فعالیت ضد التهابی (-)-epigallocatechingallate (EGCG) مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد مصرف روزانه 1200 میلی لیتر چای سبز به مدت 30 روز توسط 15 داوطلب باعث کاهش سطح کلسترول و LDL پس از 15 روز شد، اما این اثر پس از 30 روز ماندگار نشد. EGCG، کاتچین اصلی چای سبز، اثر ضد التهابی در موشها و اثر آنتیاکسیدانی در فیبروبلاستهای کشتشده انسانی نشان داد (127). بر اساس نتایج مطالعه حاضر، عصاره چای سبز بهطور قابلملاحظهای میتواند سایتوکاینهای پیش التهابی TNFα، IL-6 و βIL-1 که در اثر عفونت با ویروس آنفلوانزا به مقدار زیادی ترشح میشوند را کاهش دهد؛ بنابراین، به نظر میرسد میتوان از این ترکیب بهعنوان داروی مکمل همراه با داروهای ضد ویروسی کنونی در عفونت شدید آنفلوانزا و همچنین سایر ویروس ها مانند کرونا ویروس جهت به حداقل رساندن آسیبهای ریوی ناشی از التهاب استفاده نمود.