پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله گیاهان دارویی همواره بعلت در برداشتن اثرات ضد سرطان مورد مطالعه قرار گرفته اند. پتانسیل بالای برخی از آن ها منجر به استخراج ترکیبات موثر بعنوان دارو شده است. به این علت استفاده از گیاهان دارویی بعنوان درمان مکمل و جانبی در بیماران مبتلا به سرطان افزایش یافته است. در این مطالعه اثر ضد سرطان عصاره هیدرو الکلی خارشتر با نام علمی Alhagi maurorum (A.m) به تنهایی و در ترکیب با دوسیتاکسل (DTX) بر روی سرطان سینه القا شده با سلول های 4T1 در موش های balb/c مورد بررسی قرار گرفت. روش اجرا در این مطالعه 56 موش ماده BALB/c با سن 8-6 هفته و وزن متوسط 20 گرم از انستیتو پاستور ایران خریداری شد. موش ها از ده روز قبل از شروع آزمایشات در شرایط استاندارد 12 ساعت روشنایی/ 12 ساعت تاریکی در cº 25 و تغذیه استاندارد و آب تمیز نگهداری شدند تا به محیط عادت کنند. رده سلولی 4T1 کارسینومای سرطان سینه موش یک مدل حیوانی برای ایجاد سرطان سینه مرحله VΙ انسانی است و برای مطالعات in vitro (قابل رشد در محیط کشت) و in vivo (قابل رشد در موش BALB/c) مفید می باشد. همچنین این رده دارای ویژگی هایی است که آن را برای مطالعات سرطان سینه انسان مناسب کرده است. برای انجام آزمایشات ابتدا عصاره خارشتر بدست آمد. سپس رده ی سلولی مذکور که از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شده بود به تعداد مناسب در پلیت های کشت (6 چاهکی) کشت داده شد و بعد از تریپسینه کردن و شستشو، بصورت 1000000 سلول در هر میلی لیتر محیط کشت فاقد FBS برای تزریق به موش ها آماده شد. غیر از 8 موش که برای گروه نرمال در نظر گرفته شده بودند، به بقیه ، 1000000 سلول 4T1 بصورت زیرپوستی به پهلوی هر موش تزریق شد. بعد از دو هفته موش هایی که توموری شده بودند به گروه های مورد مطالعه تقسیم شدند و تیمار شروع شده و سه هفته ادامه داشت. در خاتمه 6 موش از هر گروه برای تست های بیوشیمی خون، هیستولوژی و بیان ژن انتخاب و کشته شدند. همچنین در طول دوره ی تریت، وزن موش ها و اندازه تومور (با کولیس) هفته ای یکبار اندازه گیری شد. از هر موش تومور، بافت سینه و کبد به منظور بررسی بیان ژن های HIF-1، FZD7، β-catenin، VEGF و MMP2 مرتبط با مسیر سیگنالینگ WNT در -70°C ذخیره شدند. فعال شدن سیگنالینگ WNT در سرطان اغلب منجر به epithelial- mesenchymal transition (EMT) می شود و مهاجرت سلول ها و تهاجم را تقویت می کند. در واقع با بررسی میزان بیان این ژن ها به این نتیجه خواهیم رسید که آیا عصاره خارشتر با تاثیر بر مسیر سیگنالینگ WNT و تغییر بیان ژن های درگیر به روند بهبودی سرطان کمک می کند یا خیر. به منظور بررسی هیستولوژی بافت های تومور، سینه، کبد و ریه در فرمالدهید 10% فیکس شدند. همچنین از هر موش چند سی سی خون برای تست های بیوشیمیایی و بررسی اوره، کراتینین، ALP، AST و ALT گرفته شد. نهایتا با تست های آماری مناسب، نتایج بدست آمده تجزیه و تحلیل شد و نتایج به دست آمده از گروه کنترل و داروهای اثر داده شده با هم مقایسه شدند. از نرم افزار آماری GrafgPad Prism در محاسبات آماری استفاده شده است. یافته ها اثر خارشتر، دوسیتاکسل و ترکیب آنها بر بیان ژن های β-Catenin، FZD7، HIF-1α، MMP2 و VEGF-A در بافت تومور و کبد بررسی شد. بر اساس نتایج حاصل شده در بافت تومور بیان ژن های FZD7 و MMP2 در همه گروه های درمانی کاهش یافت. FZD7 در گروه های A.m (500µg/ml) و (500µg/ml) + DTX A.m در حد DTX کاهش یافت. HIF-1α در گروه های DTX، A.m (1000 µg/ml) ، A.m (500 µg/ml)+DTX و A.m(500 µg/ml)+DTX کاهش معنی داری داشت. کاهش بیان ژن VEGF-A نیز در گروه های A.m (500µg/ml) و A.m (1000µg/ml) نسبت به گروه DTX معنادار بود. در بافت کبد نیز بیان ژن های FZD7 و MMP2 در همه گروه های درمانی نسبت به کنترل توموری کاهش یافت، که این کاهش در گروه A.m (500 µg/ml)+DTX اهمیت زیادی دارد. β-Catenin در گروه A.m (1000µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX نسبت به گروه کنترل توموری و گروه A.m (500 µg/ml)+DTX نسبت به DTX کاهش معنی داری نشان داد که می تواند بیانگر سینرژی باشد. HIF-1α و VEGF-A در برخی گروه ها کاهش بیان نشان دادند گرچه معنی دار نبود. بحث و نتیجه گیری در این مطالعه نتایج مفیدی حاصل شد که نشان داد گیاه دارویی خارشتر با نام علمی A.maurorum دارای پتانسیل خوبی در مهار رشد تومورهای سرطانی 4T1 هستند. همچنین A.m در ترکیب با DTX رفتار سینرژی از خود نشان داد. قبلا برخی مطالعات اثر عصاره های دی اتیل اتر و پترولیوم A.m را روی رده سرطانی MCF7 بررسی کرده و IC50 حدود 114.7 و µg/ml 105.7 را گزارش کرده بودند (11). همچنین اثر ضد سرطانی A.m روی رده های سلولی A549, MCF7, HepG2, HT-29 و MDBK بررسی شده بود (14). برخی مطالعات نیز نشان داده اند که ترکیبات گیاهی سایتوتوکسیسیته داروهای شیمی درمانی را افزایش می دهند مثلا در یک مطالعه جینسینگ سایتوتوکسیسیته دوسیتاکسل، سیسپلاتین و دوکسوروبیسین را بالا برد (15). بررسی بیان ژن ها با استفاده از Real-time PCR در دو بافت تومور و کبد انجام شد. طی این آزمایشات مشخص شد در بافت تومور، ژن β-catenin در گروه های تیمار شده با A.m(500 µg/ml) و DTX+ A.m(1000 µg/ml) افزایش معنی دار و در گروه های A.m (1000 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+ DTX کاهش می یابد، گرچه معنی دار نیست. ژن FZD7 در همه گروه های تریت شده مخصوصا در گروه های A.m (500 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX کاهش معنی دار نشان داد. کاهش بیان ژن HIF-1α در گروه های کامبینیشن A.m (500 µg/ml)+DTX و A.m(1000 µg/ml)+DTX و DTX معنی دار بود. ژن MMP2 در همه گروه های درمان کاهش معنی دار نشان داد که این کاهش در گروه های A.m(500 µg/ml) و A.m (1000 µg/ml) بیشتر بود. ژن VEGF-A در گروه های A.m (500 µg/ml) و A.m (1000 µg/ml) حتی نسبت به گروه DTX نیز کاهش معنی دار نشان داد. در بافت کبد: ژن β-catenin در گروه های درمانی A.m(1000 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX نسبت به گروه کنترل توموری کاهش معنی داری داشت و در گروه کامبینیشن A.m (500 µg/ml)+DTX کاهش بیان حتی نسبت به گروه DTX هم معنی دار بود که در اینجا می تواند بیانگر سینرژی باشد. FZD7 در همه گروه ها کاهش بیان معنی دار نشان داد که این کاهش در مورد A.m (500 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX شدیدتر بود. ژن HIF-1α گرچه در گروه A.m(1000 µg/ml)+DTX افزایش بیان نشان داد ولی در گروه های A.m (500 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX کاهش بیان داشت که معنی دار هم نبود. ژن MMP2 در همه گروه ها مخصوصا A.m (500 µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX کاهش بیان معنی دار نشان داد. بیان VEGF-A در گروه A.m (500 µg/ml) نسبت به گروه نرمال کاهش نشان داد. قبلا در مطالعه ای دیگر A.m سطح بیان ژن های p53، caspase3 و bax را در رده های MCF7 و MA-MB-231 کاهش و بیان bcl-2 را افزایش داده بود (16). DTX برای درمان بیماران سرطان سینه کاربرد دارد (17)،اما دارای عوارض جانبی می باشد. کنترل این عوارض جانبی به بیماران کمک خواهد کرد. با توجه به اینکه A.m توانست رشد تومور سرطانی 4T1 را کاهش دهد و بر بیان برخی ژن های درگیر در این زمینه اثر داشت و در برخی گروه های درمانی در حد DTX اثر داشت، میتواند در ترکیب با DTX از عوارض جانبی آن بکاهد. با توجه به اطلاعات بدست آمده قبلی A.m دارای زمینه گسترده مطالعاتی فیتوشیمیایی و فارماکولوژیک برای تایید پتانسیل درمانی است (18).

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها اثر خارشتر، دوسیتاکسل و ترکیب آنها بر بیان ژن های β-Catenin، FZD7، HIF-1α، MMP2 و VEGF-A در بافت تومور و کبد بررسی شد. بر اساس نتایج حاصل شده در بافت تومور بیان ژن های FZD7 و MMP2 در همه گروه های درمانی کاهش یافت. FZD7 در گروه های A.m (500µg/ml) و (500µg/ml) + DTX A.m در حد DTX کاهش یافت. HIF-1α در گروه های DTX، A.m (1000 µg/ml) ، A.m (500 µg/ml)+DTX و A.m(500 µg/ml)+DTX کاهش معنی داری داشت. کاهش بیان ژن VEGF-A نیز در گروه های A.m (500µg/ml) و A.m (1000µg/ml) نسبت به گروه DTX معنادار بود. در بافت کبد نیز بیان ژن های FZD7 و MMP2 در همه گروه های درمانی نسبت به کنترل توموری کاهش یافت، که این کاهش در گروه A.m (500 µg/ml)+DTX اهمیت زیادی دارد. β-Catenin در گروه A.m (1000µg/ml) و A.m (500 µg/ml)+DTX نسبت به گروه کنترل توموری و گروه A.m (500 µg/ml)+DTX نسبت به DTX کاهش معنی داری نشان داد که می تواند بیانگر سینرژی باشد. HIF-1α و VEGF-A در برخی گروه ها کاهش بیان نشان دادند گرچه معنی دار نبود.

فایل های پژوهش