پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله سرطان کلورکتال یکی از مهمترین سرطان‌هاست که 1.4 میلیون فرد در دنیا مبتلا به این بیماری هستند و700,000 نفر از این تعداد منجر به مرگ می شوند [1]. سرطان کلورکتال از لحاظ مشخصات اپیدمیولوژیکی در قسمت‌های مختلف دنیا متفاوت است [2]، به طوری که شیوع سالیانه در اروپا و آمریکای جنوبی تقریبا 50-30 مورد در هر 100,000 نفر در حالی که در آسیا 7 مورد در هر 100,000 فرد تخمین زده شده است [3]. بر طبق گزارش‌های سالانه مرکز ملی سرطان، شیوع سرطان کلورکتال در ایران 25 سال اخیر افزایش یافته است [4]. پولیپ‌های کولون در 10-5 درصد جمعیت عمومی وجود دارند [5, 6]. این سرطان به عنوان یکی از مهم ترین سرطان ها در دو جنس مطرح است [7, 8]. بر اساس آمار اداره¬ی سرطان مرکز مدیریت بیماری ها در سال 84 در ایران، تعداد موارد بروز سرطان روده ی بزرگ 4056 بوده که این تعداد 7.3% کل موارد سرطان را شامل می شود. این سرطان رتبه¬ی چهارم را در بین کل بیماری های سرطانی و رتبه ی دوم را در بین سرطان های دستگاه گوارش (بعد از معده با 10.4%) دارد. این سرطان در ایران در زنان رتبه ی سوم و در مردان رتبه ی پنجم را دارد و در استان های مختلف پراکندگی یکسانی دارد [8]. این سرطان سومین سرطان شناخته شده در جهان و همچنین سومین سرطان رایج در بین ایرانیان است و آنها را در سنین جوانی تهدید می کند [9, 10]. حدود 40 الی 50 درصد از بیمارانی که متحمل قطع درمان کارسینومای کولورکتال می شوند ممکن است از عود بیماری و متاستاز آن از بین بروند [11, 12]. پتانسیل بدخیمی آدنوماهای کولون و رکتوم، براساس نوع هیستولوژیکی، سایز و درجه (Grade) اپیتلیال تغییر یافته متفاوت است. شواهد پیشنهاد می کنند که اکثر سرطان‌های کولون و رکتوم از طریق تکامل پولیپ‌های مستعد کننده سرطان بوجود می‌آیند. اکثر این آدنوماها در سراسر طول عمر یک فرد بالغ به آدنوکارسینوما تبدیل نمی‌شوند و فقط تعداد کمی از پولیپ‌ها ممکن است پتانسیل بدخیمی پیدا کنند [13]. یکی از فراوان‌ترین دلایل مرگ و میر بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال گسترش متاستاتیک سلول‌های توموری می‌باشد. متاستاز یک فرایند چند مرحله‌ای می‌باشد که سلول‌های سرطانی از تومور اولیه جدا شده و با آسیب‌های ثانویه در ارگان‌های دوردست لانه گزینی می‌کنند [14, 15]. تومورهای کلورکتال معمولا به ارگان‌های دوردست همچون کبد و ریه متاستاز می‌دهند. در نبود متاستاز کبد و ریه متاستاز به استخوان با شیوع کمتر و شدت بیشتر روی می‌دهد [16]. تنوعی از تغییرات ژنتیکی با سرطان کولورکتال پیوستگی نشان داده اند که شامل حذف ژن های مهار کننده ی تومور و فعالسازی انکوژن های غالب است. بطور معمول تغییرات ژنتیکی می تواند در هریک از مراحل ترانسفورماسیون نئوپلاستیک اتفاق بیفتد که باعث هتروژنی جمعیت تومور می شود. پیشرفت تومور به علت انتخاب کلون¬های بدخیم است. نئوپلازی کولورکتال فرصت مناسبی را برای مطالعه ی این پیشرفت فراهم می¬کند. بنظر می رسد اکثر کارسینوماها از آدنوما منشا می گیرند، که چندین نوع تغییر ژنتیکی را که در خلال تغییر از فنوتیپ خوش خیم به بدخیم انباشته شده است حمل می کند [17]. در سال های اخیر تعیین نقش ژن های دخیل در سرطان و مکانیسم های مولکولی در خلال کارسینوژنز و پیشرفت سرطان کولورکتال ، فرصت مناسبی را برای توسعه ی درمان هدفمند سرطان کولورکتال ایجاد کرده است [18]. در بسیاری از مطالعات مشخص شده است که ژن PLK2 به عنوان ژن سرکوب کننده¬ی تومور بوده و هم¬چنین مشخص شده است که در بسیاری از سرطان¬ها کاهش بیان می¬یابد. با این وجود Hao و همکاران در مطالعه-ای که بر روی 116 نمونه¬ی توموری در مقایسه با نمونه¬ی نرمال مجاور انجام دادند، مشخص نمودند که بیان این ژن در نمونه¬های توموری در مقایسه با نمونه¬های نرمال مجاور افزایش یافته است که این نتیجه مغایر با پتانسیل سرکوب کنندگی تومور در این ژن می¬باشد. هم¬چنین بیان این ژن در سطح پروتئینی نیز در نمونه¬های توموری نسبت به غیر تومور افزایش بیان نشان داده است. به علاوه در این مطالعه ارتباط معناداری میان اندازه¬ی تومور، تهاجم به غدد لنفاوی و stage با افزایش بیان این ژن وجود دارد. بیمارانی که دارای افزایش بیان در این ژن بودند، از لحاظ مدت زمان زنده ماندن، مدت زمان کمتری را نسبت به افرادی که بیان این ژن در آن¬ها افزایش نیافته بود، زنده ماندند. نکته¬ی مهم دیگری که در مورد این ژن مشخص گردید این بود که این ژن از طریق مورد هدف قرار دادن Fbxw7/CyclinE تکثیر سلولی و آپوپتوز را تنظیم می¬نماید. هم¬چنین افزایش بیان این ژن سبب افزایش رشد سلول¬های سرطانی می¬گردد [19]. در مطالعه¬ای که توسط Wafik و همکاران انجام شد، بررسی بیان ژن PLK2 در سطح پروتئینی انجام گرفت که در این مطالعه از دست رفتن بیان این ژن در سطح پروتئینی در نمونه¬های آدنوکارسینوکای کلورکتال مشاهده شد. همچنین مشخص گردید از دست رفتن بیان این ژن در سطح پروتئینی همراه با افزایش بیان MTOR و S6 فسفریله می¬باشد. در واقع با فعال¬سازی مسیر mTOR، سلول توموری ویژگی افزایش رشد و تکثیر را کسب می¬نماید [20]. Chen و همکاران با مطالعه¬ی بیان این ژن در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال مشخص نمودند که افزایش و کاهش بیان این ژن در بیماران مشاهده می¬¬گردد. بر این اساس بیماران به دو گروه تقسیم شدند که از بین این دو گروه بیمارانی که دارای افزایش بیان هستند نسبت به شیمی درمانی مقاومت نشان داده و مدت زمان زنده ماندن آن¬ها کاهش یافته است. این نتایج در افراد با بیان کمتر این ژن مشاهده نشد و یا کمتر مشاهده گردید [21]. در مطالعه¬ای که توسط Tao و همکاران بر روی رده¬ی سلولی HT-29 انجام گردید، مشخص گردید که با خاموش سازی ژن PLK2 میزان تکثیر در سلول¬های سرطانی کلورکتال کاهش یافته و هم چنین از طریق 1FOXD آپوپتوز نیز افزایش یافته است [22]. بنابراین با توجه به نتایج تحقیقات مختلف و عدم هم¬خونی آن ها با یکدیگر ، این ژن برای بررسی در تحقیق ما انتخاب گردید. ژن SMOX ژن کد کننده ی پروتئین است که با نام های دیگر PAO ،PAO-1 و SMOنیز شناخته می شود. ژن تک کپی SMOX در پستانداران شامل 7 اگزون می باشد و روی کروموزوم 20 انسانی قرار دارد و مکانیسم های تکاملی پیرایش متناوب را برای افزایش تنوع عملکرد اتخاذ کرده است. این ژن چندین واریانت را کد می کند و دارای 2 ایزوفرم عملکردی SMO1 و SMO5 است [23]. بیان این ژن در مطالعات مختلف سنجیده شده است. در یکی از این مطالعات Cervelli M و همکاران در سال 2010 سطح ترانسکریپت و فعالیت آنزیم SMO را بررسی کردند؛ میزان ترانسکریپت و فعالیت آنزیمSMO در نمونه های توموری نسبت به نمونه های غیر توموری سرطان پستان ، کاهش بیان نشان داده و با توجه به کاهش بیان این ژن در سرطان پستان آن را بعنوان بیومارکر منفی معرفی کردند [24]. بر خلاف مطالعه ی قبلی مطالعات دیگری انجام شد که افزایش بیان این ژن را گزارش کردند؛ با توجه به اینکه افراد مبتلا به کولیت اولسراتیو ، مستعد ابتلا به سرطان کولورکتال هستند و در این افراد تعادل بین پلی آمین های اسپرمین و اسپرمیدین بهم می خورد. Hong SK و همکاران به منظور تعیین نقشSMO در این بیماری در سال 2010 بیان ژن SMOX را در افراد مبتلا به کولیت اولسراتیو و نمونه های کنترل با روش Real time RT-PCR بررسی کردند و افزایش بیان این ژن را در نمونه های کولیت اولسراتیو نسبت به نمونه های کنترل مشاهده کردند [25]. وجود التهاب در بدخیمی های پروستات و از طرف دیگر افزایش گونه های فعال اکسیژن و آسیب DNA در پاسخ به القاSMO در سرطان های ریه و معده، یک ارتباط مکانیکی بین ایجاد التهاب ،فعالیت SMO، تولید ROS و بدخیمی های پروستات گزارش می دهد؛ به همین منظور Goodwin AC و همکاران در سال 2008 به منظور تعیین نقشSMO در بدخیمی های پروستات، بیان این ژن را در بیماران مبتلا به سرطان پروستات و افراد سالم بررسی کردند و شاهد افزایش بیان این ژن در افراد بیمار بودند [26]. در مطالعات پیشین القا SMOX توسط باکتری هلیکوباکتر پیلوری در سلول های اپیتلیالی معده آلوده شده به این باکتری، در شرایط استرس مشاهده شده بود. Chaturvedi R و همکاران در سال 2012 به بررسی عملکردSMOX در واسطه گری کارسینوژنز القا شده با هلیکوباکتر پیلوری و انکوپروتئین میکروبی cogA پرداختند و در واقع به تعیین نقش cogA در القا SMOX در شرایط آلوده شدن سلول اپیتلیالی معده به این باکتری پرداختند. با بررسی بیان SMO در سلول های اپیتلیال cagA+ و cagA- افزایش بیان SMOX را در نمونه های مثبت مشاهده کردند که نشان دهنده ی القا SMO توسط cogA بوده و همچنین با القا SMO سلول هایی تولید می شود که دارای DNA آسیب دیده هستند و زیرمجموعه ای از این سلول ها مقاوم به آپوپتوز بوده و دارای ریسک بالا برای بدخیم شدن هستند [27]. روش اجرا نوع مطالعه و نمونه گیری این مطالعه از نوع توصیفی کاربردی است. افراد مورد مطالعه به طور تصادفی از بین مراجعه کنندگان به بیمارستان الزهرای اصفهان انتخاب شدند. در این پروژه 35 جفت نمونه از بافت توموری و بافت غیرتوموری مجاور از 35 فرد مبتلا به سرطان کورکتال که تحت نمونه‌برداری قرار گرفته بودند با رضایت افراد بیمار شرکت داده شد. انتخاب 35 نمونه بیمار براساس اطلاعات مندرج در پرونده دارای این شرایط بودند: ۱. نمونه از یکی از شایعترین نوع سرطان کلورکتال باشد. ۲. نمونه مربوط به اشخاصی باشد که تازه بیماریشان تشخیص داده شده و تحت درمان‌های شیمی وپرتودرمانی قرار نگرفته باشند؛ که ازطریق نمونه گیری در دسترس (آسان) وارد پژوهش شدند. ۳. بافت شاهد و نرمال نیز از بافت مجاور تومور تحت نظر پاتولوژیست بدست آمد. ۴. تعیین حجم نمونه بااستفاده از فرمول N=(Z1-α/2+Z1-β)2S2/d2 انجام گرفت. 3-۳-2- نحوه انتخاب ژن انتخاب ژن مورد مطالعه بر اساس مطالعات پیشین و همچنین اطلاعات موجود در پایگاه داده‌های سرطان‌شناسی انجام پذیرفت. در این پایگاه داده‌ها از جمله پایگاه داده Oncomine ژن PLK2 و SMOX به عنوان یک ژن با پتانسیل بالا برای تغییر بیان در سرطان‌های مختلف معرفی شده بود. سپس در پایگاه‌هایی چون NCBI و Ensembl این ژن مورد بررسی قرار گرفت و مقالاتی که مرتبط با مطالعه این ژن بودند بررسی شدند. ۳-۳-۳- طراحی پرایمر طراحی پرایمر با استفاده از نرم افزار Oligo7 و به صورت دستی انجام شد و اختصاصیت و سایر ویژگی‌های مورد نظر با به کارگیری نرم افزارهای آنلاین Mfeprimer و Oligoanalyzer بررسی شد. پرایمرها به صورتی طراحی شدند که روی مرز بین دو اگزون واقع شوند (اتصال اگزون-اگزون) تا از تکثیر احتمالیDNA در صورت آلودگی ممانعت به عمل آید ( جدول ۱.۳توالی پرایمرها). پس از دریافت پرایمرها، ابتدا به پرایمرهای لیوفیلیزه به حجمی که در دستورالعمل همراه پرایمر بود آب افزوده شد و بعد از گذشت 30 دقیقه از استوک که غلظتی برابر با 100 پیکومول در میکرولیتر داشت جهت تهیه پرایمر مناسب انجام واکنش PCR با غلظت 10 پیکومولار استفاده شد. 3-۳-4- استخراج RNA از بافت پارافینه به منظور فراهم آوردن امکان سنجش میزان بیان ژن مورد نظر نیاز بود که ابتدا استخراج RNA از بافت پارافینه صورت گیرد و این مرحله با سنتز cDNA دنبال شود. از کیت RNeasy FFEP Qiagen kit جهت استخراج استفاده شد. این کیت شامل بافر RBC، بافر RPE، بافر PKD، پروتییناز K، بافر DNaseI، DNaseI ، آب نوکلئازفری، ستون MinElut و میکروتیوب برای ستون بود. در این کیت در مرحله ی اول باید از هپتان و متانول و اتانول استفاده نمود که در کیت موجود نبوده و باید به صورت جداگانه تهیه شود. ۱-۴-۳-۳- مراحل استخراج قبل از استفاده از مواد، پروتییناز K که به حالت پودر بود با افزودن 550 میکرولیتر آب نوکلئازفری به حالت مایع درآمد و از آن پس تا اولین مرحله استفاده در دمای 20- نگهداری شد؛ پس از یک بار استفاده از آن پس این آنزیم در دمای 4 درجه نگهداری شد. همچنین نیاز بود که بافر RPE با افزودن 44 میلی‌لیتر اتانول مطلق به نسبت 1 به 5 رقیق شود. ستون MinElut باید در دمای 4 درجه و سایر مواد در دمای اتاق نگهداری می‌شدند. دستورالعمل کار با این کیت به شرح زیر است: ۱. مقدار 500 میکرولیتر هپتان به برش‌های بسیار نازک که در تیوب 5.1 میلی‌لیتری قرار داشت افزوده و به شدت در دور 2500RPM ورتکس شد و به مدت 10 دقیقه در محیط آزمایشگاه قرار داده شد. ۲. در این مرحله مقدار 25 میکرولیتر متانول به تیوب افزوده شد و در دور 2500RPM ورتکس و سپس به مدت 2 دقیقه در 11000RPM سانتریفوژ شد. ۳. فاز بالایی دور ریخته شد. ۴. مرحله 1 تا 3 دوباره تکرار شد. ۵. درب تیوب‌ها باز گذاشته شد و برای مدت 10 دقیقه در محیط آزمایشگاه قرار داده شد تا خشک شود. ۶. مقدار 240 میکرولیتر بافر PKD افزوده و ورتکس شد و سپس 1 دقیقه با دور 10000 سانتریفوژ شد. ۷. میزان 10 میکرولیتر پروتییناز K افزوده شد و بعد با 2 تا 3 بار پیپتینگ مخلوط شد. ۸. دقیقه در 56 درجه قرار داده شد و هر 5 دقیقه یک بار تکان داده شد. سپس برای 15 دقیقه در 80 درجه قرار داده شد و هر 5 دقیقه یک بار تکان داده شد. ۹. به مدت 3 دقیقه روی یخ انکوبه شد و برای 15 دقیقه در دور 13500 سانتریفوژ شد. ۱۰. فاز رویی به یک میکروتیوب 2 میلی‌لیتری جدید منتقل شد و به اندازه یک دهم حجم نمونه (بین 16 تا 25 میکرولیتر) بافر DNaseI و مقدار 10 میکرولیتر DNaseI به آن اضافه گشت و 15 ثانیه در 10000 دور سانتریفوژ شد. ۱۱. به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. ۱۲. مقدار 500 میکرولیتر بافر RBC اضافه و مخلوط شد. ۱۳. میزان 1200 میکرولیتر اتانول مطلق افزوده گشت و به خوبی مخلوط شد. ۱۴. مقدار 600 میکرولیتر از نمونه به ستون MinElut موجود در کیت افزوده شد و به مدت 15 ثانیه در 10000 دور در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شد . مایع رویی دو ریخته شد و این مراحل برای حجم باقی مانده از نمونه تکرار شد. ۱۵. در این مرحله مقدار 500 میکرولیتر از بافر RPE به ستون افزوده شد و برای 15 ثانیه با درب بسته در 10000 دور سانتریفوژ شد. مایع دور ریخته شد. ۱۶. مقدار 500 میکرولیتر از بافرRPE به ستون افزوده گشت و به مدت 2 دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ شد و مایع خارج شد. ۱۷. ستون در یک میکروتیوب 2 میلی‌لیتری جدید قرار داده شد و برای مدت 15 دقیقه با دور 10000 سانتریفوژ شد.(به صورت درب‌ باز، بین میکروتیوب‌ها فاصله بود و درب‌ها در خلاف جهت گردش روتور قرار گرفتند.) ۱۸.ستون به یک میکروتیوب 5.1 منتقل شد و مقدار 20 میکرولیتر آب نوکلئازفری به ستون افزوده گشت و به مدت یک دقیقه در دور بالا سانتریفوژ شد.(با درب بسته) ۱۹. ستون دور ریخته شد و میکروتیوب حاویRNA در دمای 20- برای استفاده سریع جهت سنتز cDNA قرار داده شد. 3-۳-5- سنتز cDNA برای سنتز cDNA از آنزیم Super ScriptII کمپانی Invitrogen که شامل آنزیم سوپر اسکریپت، DDT و 5x First strand buffer بود استفاده شد. همچنین رندوم هگزامر و dNTPs از شرکت تاکارا تهیه شد. -مراحل کار سنتز cDNA ۱. مقدار 1 میکرولیتر از راندوم هگزامر، 1 میکرولیتر RNA و 1 میکرولیتر dNTP به یک میکروتیوب 2.0 میلی‌لیتری وارد شد و به آن 11 میکرولیتر آب نوکلئازفری اضافه شد. ۲. میکروتیوب به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه انکوبه شد و سپس روی یخ به سرعت سرد و سانتریفوژ شد. ۳. میزان 4 میکرولیتر از بافر 5X به همراه 2 میکرولیتر از DDT به میکروتیوب اضافه و به آرامی مخلوط شد. ۴. به مدت 2 دقیقه در 25 درجه انکوبه شد. ۵. سپس مقدار 1 میکرولیتر آنزیم سوپر اسکریپت به آن اضافه و به آرامی پیپتینگ صورت گرفت. ۶. مدت 10 دقیقه در 25 درجه، سپس 50 دقیقه در 42 درجه و نهایتا 15 دقیقه در 70 درجه انکوبه شد. ۷. میکروتیوب برای نگه داری کوتاه مدت به فریزر 20- منتقل شد (در صورت نگهداری طولانی مدت باید در دمای 80- نگهداشته شود). جهت اطمینان از صحت عملکرد پرایمرهای طراحی شده و همچنین پروسه سنتز cDNA واکنشPCR در دستگاه ترمال سایلکر ستاپ شد و بعد از رویت باند مورد نظر بر روی ژل آگارز نسبت به انجام آزمون Real time RT-PCR اقدام شد. 3-۳-6- آزمون Real time RT-PCR برای این منظور از سایبرگرین شرکت تاکارا بهره برده شد. برای هر واکنش به حجم نهایی 10 میکرولیتر، مقدار 5 میکرولیتر سایبرگرین به انضمام 2.0 میکرولیتر از هر پرایمر، 1 میکرولیتر از cDNA و 6.3 میکرولیتر آب نوکلئازفری استفاده شد این روند بر روی یخ صورت گرفت. استریپ‌ها به درون جایگاه مخصوص در دستگاه Rotor gene قرار داده شدند و برنامه مورد نظر که در جدول ۲.۳ آمده برای هر ژن اعمال شد. 3-۳-7- تفسیر نتایج و روش‌های آماری از فرمول 2-ΔΔCt برای به دست آوردن میزان تغییرات Relative fold change)) بهره برده شد. در این روش مقدار Ct هر نمونه برای ژن کنترل داخلی از مقدار Ct هر نمونه برای ژن مورد بررسی کم شد و به این شکل دلتا محاسبه گشت. از مقادیر ΔCt نمونه های کنترل میانگین گرفته شد و این مقدار از ΔCt هر نمونه (توموری و کنترل) کم شد و به این ترتیب مقدار ΔΔCt بدست آمد. در نهایت با قرار دادن این مقدار برای هر نمونه در فرمول 2-ΔΔCt مقدار تغییرات بدست آمد. با استفاده از روش آماری Paired T Test نمونه‌های کنترل و توموری به لحاظ معنادار بودن تغییرات مورد سنجش قرار گرفتند. با استفاده از روش آماری Mann–Whitney و Kruskal–Wallis نمونه‌ها از نظر سن، جنس و مرحله بیماری با یکدیگر مقایسه شدند. یافته ها 3-4- یافته ها 3-۴-1- بیماران تعداد 35 جفت نمونه توموری کلورکتال به همراه بافت نرمال حاشیه تومور جراحی‌های کلوکتومی بیمارستان الزهراء اصفهان جمع‌آوری و به فریزر منفی هشتاد درجه سانتی گراد منتقل شد. ۱-۱-۴-۳- بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده برای تعیین مقدار RNA موردنظر از نانودراپ استفاده شد و میزان غلظت RNA و نیز نسبت جذب 260 به 280 مورد بررسی قرار گرفت که در مورد اکثر نمونه‌های مورد بررسی در محدوده طبیعی (2-7.1) قرار داشت. نسبت بالاتر از 2 و پایین‌تر از 7.1 به ترتیب نشانه آلودگی با DNA و پروتئین می‌باشد. ۲-۴-۳- تائید اختصاصیت پرایمرها بر روی ژل آگارز همان‌طور که بررسی منحنی ذوب نشان داد، تکثیر انجام ‌گرفته برای ژن‌های PLK2 ، SMOX و ACTB یک تکثیر اختصاصی می‌باشد، نتایج ژل آگارز نیز برای دو ژن SMOX و PLK2 مؤید همین یافته‌ها بود. ۳-۴-۳- نتایج Real-Time PCR برای ژن‌های PLK2 ، SMOX و ACTB تکنیک Real-Time PCR برای 35 جفت نمونه شامل 35 نمونه تومورال کلورکتال، 35 نمونه نرمال از همان بیمار به‌ منظور سنجش سطح بیان نسبی ژن PLK2 و سطح بیان نسبی ژن SMOX نسبت به کنترل داخلی ACTB انجام شد. برای انتخاب کنترل داخلی مناسب، با مطالعه منابع معتبر، نهایتاً ACTB به دلیل نشان دادن کمترین تغییرات در نمونه‌های بیمار سرطان کلورکتال و سالم به‌عنوان کنترل داخلی انتخاب شد. ۴-۴-۳- نتایج آنالیزهای آماری ۱-۴-۴-۳- آنالیز بیان ژن¬های PLK2 و SMOX بیان نسبی ژن های PLK2 و SMOXبا استفاده از روش ΔΔCt تعیین شد. نتایج qRT-PCR نشان داد که بیان ژن¬های PLK2 و SMOX در نمونه‌های توموری بافت کلورکتال در مقایسه با بافت‌های غیرتوموری مجاورش تغییری معناداری نشان نداد (شکل۲.۳). P-value برای ژنPLK2 و SMOX به ترتیب برابر با 0.32 و 0.35 بود. ۲-۴-۴-۳- ویژگی‌های پاتولوژی و بیان ژن بیان نسبی ژن های PLK2 و ژن SMOX در نمونه‌های بافت سرطانی بررسی شد تا ارزیابی شود که آیا بین بیان این ژن و ویژگی‌های پاتولوژی ارتباطی وجود دارد یا نه؟ ارتباط بیان نسبی ژن و ویژگی‌های پاتولوژی که آنالیز شد شامل: سن، جنس، عمق تهاجم، grades تومور، تهاجم محیطی، تهاجم لنفاتیک، تهاجم رگی و سایز تومور بودند. بیان ژن PLK2 نشان داد که تغییر معناداری بین بیان این ژن و ویژگی‌های پاتولوژی اصلی همچون: سن، سایز تومور، سیستم TNM و متاستاز، وجود ندارد و تنها ارتباط معناداری میان بیان این ژن وجنسیت بیماران مشاهده گردید (P=0.04). هم چنین میان بیان ژن SMOX و ویژگی‌های پاتولوژی اصلی همچون: سن، سایز تومور، سیستم TNM و متاستاز هیچ ارتباط معناداری وجود ندارد. هم چنین برخلاف ژن PLK2 ، هیچ ارتباط معناداری میان بیان ژن SMOX و جنسیت افراد بیمار مشاهده نشد. بیان نسبی ژن PLK2 و SMOX و پارامترهای کلینیکی پاتولوژی در سرطان کلورکتال در جدول های ۳.۳ و ۴.۳ خلاصه شده است. بحث و نتیجه گیری ۵-۳- بحث و پیشنهاد ۱-۵-۳- بحث در این مطالعه ما به بررسی بیان ژن¬های PLK2 و SMOX در نمونه¬های سرطان کلورکتال در مقایسه با بافت مجاور پرداختیم. بیان ژن¬ PLK2 در نمونه‌های توموری بافت کلورکتال در مقایسه با بافت‌های غیرتوموری مجاورش، تغییر معناداری نشان نداد و تنها میان بیان ژن PLK2 و جنسیت بیماران ارتباط مشاهده گردید. در مطالعه¬ای Lu و همکاران به بررسی بیان این ژن در 116 نمونه¬ی توموری در مقایسه با بافت نرمال مجاور آن پراختند. بیان PLK2 در سطح پروتئین افزایش بیان نشان داده است و این افزایش بیان PLK2 سبب افزایش رشد تومور گردیده و آپوپتوز را مهار می کند. هم چنین افزایش رشد حاصل شده به دلیل افزایش بیان این ژن توسط مسیر منتهی به Cyclin E انجام می¬گردد. [19]. به علاوه در مطالعه¬ای که Wafik و همکاران انجام دادند مشخص شد که بیان PLK2 در نمونه¬های کارسینومای سرطان کلورکتال از دست رفته است اما بیان این ژن در بیماران مبتلا به آدنومای سرطان کلورکتال افزایش یافته و افزایش بیان این ژن در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال از نوع آدنوما سبب پیشروی سرطان کلورکتال از حالت خوش خیم به بدخیم می¬گردد. به طوری که هرچه از حالت آدنومای سرطان به سمت کارسینوما پیش می¬رویم، بیان این ژن کم شده و به عبارتی از دست می¬رود. نکته¬ی دیگری که در این مطالعه ذکر شده بود یک ارتباط متقابل و دو طرفه¬ای میان از دست رفتن فعالیت P53 و PLK2 می¬باشد ، به گونه¬ای که پس از از دست رفتن فعالیت و بیان P53 و به دنبال آن از دست رفتن فعالیت و بیان PLK2 نیز مشاهده می¬شود [20]. همان طوری که قبلا نیز ذکر شد نتیجه¬ی ما عدم تغییر بیان ژن PLK2 را نشان داد و نتیجه ی تحقیق ما مغایر با مطالعات گذشته بود . دلیل این عدم هم¬خوانی می¬تواند این موضوع باشد که تعداد نمونه¬های بیماران مورد بررسی در مطالعه¬ی ما کمتر از تعداد نمونه هایی است که در مطالعات گذشته مورد بررسی قرار گرفته است. ضمن اینکه در مطالعات گذشته تغییر بیان ژن PLK2 در انواع مختلف سرطان کلورکتال متفاوت تغییر کرده است و همیشه افزایشی یا کاهش نبوده است. یکی از دلایل اینکه در مطالعه¬ی ما تغییر بیانی از این ژن در نمونه های سرطانی نسبت به نمونه¬های نرمال مجاور مشاهده نشد می¬تواند این باشد که در مطالعه¬ی ما، دسته¬بندی نمونه ها بر اساس نوع سرطان کلورکتال یعنی نوع آدنوما و کارسینوما انجام نشده و این احتمال وجود دارد که به دلیل اینکه نمونه های مورد مطالعه ترکیبی از دو حالت آدنوما و کارسینومای کلورکتال می¬باشند ، نتیجه¬ی معناداری در ارتباط با بیان این ژن مشاهده نگردید. زیرا در مطالعات مختلف ذکر شده است که بیان این ژن در انواع مختلف سرطان کلورکتال متفاوت تغییر می¬نماید و این موضوع را علت مغایر بودن نتایج تحقیقات مختلف دانسته اند. دلیل دیگری که می توان در توجیه مغایر بودن نتیجه¬ی ما با مطالعات گذشته بیان نمود این موضوع می¬تواند باشد که بیشتر مطالعات گذشته سطح این ژن را در سطح پروتئینی مورد بررسی قرار دادند و در مطالعه¬ی ما ، تنها بیان این ژن در سطح mRNA ارزیابی گردید. دلیل دیگر مغایر بودن نتیجه¬ی ما با مطالعات گذشته این است که در مطالعات گذشته همراهی از دست رفتن فعالیت P53 و PLK2 مشاهده شده است که ما در مطالعه¬ی خود به همراه بررسی PLK2 ، P53 را مورد بررسی قرار ندادیم . در واقع در تحقیقات گذشته این موضوع بیان شده بود که در ابتدا در سلول های سرطان کلورکتال بیان P53 از دست می¬رود و پس از آن بیان PLK2 از دست خواهد رفت و این موضوع موید آن است که احتمال دارد عدم مشاهده ی تغییر بیان در ژن PLK2 در نمونه¬های مورد مطالعه علاوه بر دلایل قبلی مذکور، به دلیل عدم تغییر بیان ژن P53 بوده است. که البته می ¬توان در مطالعات بعدی به بررسی ژن¬های P53 و PLK2 به صورت همزمان پرداخت. در ارتباط با ژن SMOX ، هیچ تغییر بیان معناداری میان بافت توموری و بافت نرمال مجاور آن مشاهده نشد. در مطالعات گذشته نیز بیان این ژن مورد بررسی قرار گرفته است. در مطالعه¬ای که توسط Snezhkina انجام گردید ، مشخص شد که بیان این ژن در 50 نمونه¬ی توموری سرطان کلورکتال نسبت به نمونه¬ی نرمال مجاور آن افزایش بیان داشته است. در این مطالعه هم¬چنین به بررسی ارتباط بین عفونت در دستگاه گوارش و بیان این ژن پرداختند و این نتیجه حاصل شد که زمانی که تیتر بالایی از عفونت در دستگاه گوارش وجود داشته است ، بیان SMOX نیز افزایش یافته است [20]. در مطالعه¬ی دیگری که توسط Zhang و همکاران انجام دادند، نشان داده شد که بیان ژن SMOX در رده¬ی سلولی سرطان کلورکتال و در 46 نمونه¬ی بیمار مبتلا به سرطان کلورکتال افزایش بیان این ژن مشاهده گردید [29]. در مطالعه¬ی ما هیچ تغییر بیانی در ارتباط با این ژن دربیماران مبتلا به سرطان کلورکتال مشاهده نشد. یکی از دلایل متفاوت بودن نتیجه ی ما با نتایج مطالعات مذکور می تواند تعداد بیشتر نمونه¬های بیماران مطالعات قبلی باشد. هم¬چنین تنها یک مطالعه به بررسی تاثیر و ارتباط بین عفونت دستگاه گوارش از جمله بخش روده با بیان این ژن پرداخته بود که شاید تغییر بیان این ژن می¬تواند تحت تاثیر میکروبیوم روده باشد و ما نیز در مطالعه¬ی خود در کنار بررسی ژن SMOX، اطلاعاتی از میکروبیوم روده¬ی بیماران برای آنالیز و نتیجه¬گیری در دست نداشتیم. به طور کلی مطالعات انجام شده در ارتباط با این ژن در سرطان کلورکتال بسیار کم می¬باشد و با توجه به مطالعات کم گذشته، نتیجه گیری نهایی در ارتباط با ژن SMOX و هم¬چنین بررسی دلایل عدم هم خوانی میان نتیجه¬ی ما با مطالعات گذشته کمی سخت بوده و این ژن نیازمند بررسی های بیشتر در حوزه¬ی سرطان کلورکتال می باشد . زیرا به نظر می¬رسد با توجه به اینکه این ژن در مسیرمتابولیک نقش داشته و سبب تولید ROS یا گونه¬های فعال اکسیژن از جمله H2O2 می گردد و تولید ROS می¬تواند سبب آسیب زیاد به DNA و تغییرات لازم برای ایجاد و پیشبرد سرطان کلورکتال گردد ، نقش مهم SMOX به نظر می رسد در ایجاد و پیشبرد سرطان کلورکتال انکار ناشدنی باشد. ۶-۳- پیشنهاد برای پژوهش های آینده ۱. افزایش تعداد نمونه ها هم در جنسیت مونث و هم در جنسیت مذکر صورت گیرد. ۲. گسترش جمعیت مورد مطالعه به سایر استان‌های کشور ۳. انجام این آزمایش در سطح پروتئینی علاوه بر بررسی در سطح RNA ۴. انجام آزمون¬های عملکردی براساس استفاده از مدل¬های سلولی و مدل¬های حیوانی

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها 3-4- یافته ها 3-۴-1- بیماران تعداد 35 جفت نمونه توموری کلورکتال به همراه بافت نرمال حاشیه تومور جراحی‌های کلوکتومی بیمارستان الزهراء اصفهان جمع‌آوری و به فریزر منفی هشتاد درجه سانتی گراد منتقل شد. ۱-۱-۴-۳- بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده برای تعیین مقدار RNA موردنظر از نانودراپ استفاده شد و میزان غلظت RNA و نیز نسبت جذب 260 به 280 مورد بررسی قرار گرفت که در مورد اکثر نمونه‌های مورد بررسی در محدوده طبیعی (2-7.1) قرار داشت. نسبت بالاتر از 2 و پایین‌تر از 7.1 به ترتیب نشانه آلودگی با DNA و پروتئین می‌باشد. ۲-۴-۳- تائید اختصاصیت پرایمرها بر روی ژل آگارز همان‌طور که بررسی منحنی ذوب نشان داد، تکثیر انجام ‌گرفته برای ژن‌های PLK2 ، SMOX و ACTB یک تکثیر اختصاصی می‌باشد، نتایج ژل آگارز نیز برای دو ژن SMOX و PLK2 مؤید همین یافته‌ها بود. ۳-۴-۳- نتایج Real-Time PCR برای ژن‌های PLK2 ، SMOX و ACTB تکنیک Real-Time PCR برای 35 جفت نمونه شامل 35 نمونه تومورال کلورکتال، 35 نمونه نرمال از همان بیمار به‌ منظور سنجش سطح بیان نسبی ژن PLK2 و سطح بیان نسبی ژن SMOX نسبت به کنترل داخلی ACTB انجام شد. برای انتخاب کنترل داخلی مناسب، با مطالعه منابع معتبر، نهایتاً ACTB به دلیل نشان دادن کمترین تغییرات در نمونه‌های بیمار سرطان کلورکتال و سالم به‌عنوان کنترل داخلی انتخاب شد. ۴-۴-۳- نتایج آنالیزهای آماری ۱-۴-۴-۳- آنالیز بیان ژن¬های PLK2 و SMOX بیان نسبی ژن های PLK2 و SMOXبا استفاده از روش ΔΔCt تعیین شد. نتایج qRT-PCR نشان داد که بیان ژن¬های PLK2 و SMOX در نمونه‌های توموری بافت کلورکتال در مقایسه با بافت‌های غیرتوموری مجاورش تغییری معناداری نشان نداد (شکل۲.۳). P-value برای ژنPLK2 و SMOX به ترتیب برابر با 0.32 و 0.35 بود. ۲-۴-۴-۳- ویژگی‌های پاتولوژی و بیان ژن بیان نسبی ژن های PLK2 و ژن SMOX در نمونه‌های بافت سرطانی بررسی شد تا ارزیابی شود که آیا بین بیان این ژن و ویژگی‌های پاتولوژی ارتباطی وجود دارد یا نه؟ ارتباط بیان نسبی ژن و ویژگی‌های پاتولوژی که آنالیز شد شامل: سن، جنس، عمق تهاجم، grades تومور، تهاجم محیطی، تهاجم لنفاتیک، تهاجم رگی و سایز تومور بودند. بیان ژن PLK2 نشان داد که تغییر معناداری بین بیان این ژن و ویژگی‌های پاتولوژی اصلی همچون: سن، سایز تومور، سیستم TNM و متاستاز، وجود ندارد و تنها ارتباط معناداری میان بیان این ژن وجنسیت بیماران مشاهده گردید (P=0.04). هم چنین میان بیان ژن SMOX و ویژگی‌های پاتولوژی اصلی همچون: سن، سایز تومور، سیستم TNM و متاستاز هیچ ارتباط معناداری وجود ندارد. هم چنین برخلاف ژن PLK2 ، هیچ ارتباط معناداری میان بیان ژن SMOX و جنسیت افراد بیمار مشاهده نشد. بیان نسبی ژن PLK2 و SMOX و پارامترهای کلینیکی پاتولوژی در سرطان کلورکتال در جدول های ۳.۳ و ۴.۳ خلاصه شده است.

فایل های پژوهش