پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله سرعت سریع مصرف پلاستیک در سراسر جهان منجر به ایجاد مقادیر فزاینده ای از زباله شده است. این به نوبه خود به حجم زباله های نیاز به فرآوری و / یا دفع می افزاید.(9-11) استفاده از پلاستیک‌ها زندگی ما را از خیلی جوانب تغییر داده است.(12) استفاده و تولید پلاستیک همواره خیلی زیاد بوده است زیرا آن‌ها سبک، ارزان قیمت، مقاوم در برابر خوردگی و حرارت هستند، خاصیت عایق بندی و الکتریسیته دارند. این ویژگی‌ها و سهولت در استفاده ای که دارند باعث شده است تولید پلاستیک سیر صعودی داشته باشد(13و14). بازیافت نادرست و مدیریت غلط زباله‌های پلاستیکی در اکثر کشور‌ها موجب آلودگی پلاستیکی خاک و آب و محیط زیست می‌شود(15). این حجم از پلاستیک باعث شده 26% زباله‌های محیطی را پلاستیک‌ها شامل بشوند که این مقدار زباله و نبودن مراکز دفن پلاستیک و تجزیه طولانی مدت آن باعث شده مصرف پلاستیک و تبعات زیستی آن به موضوعی جهانی تبدیل شود(16). نمودار شماره 1-3 : زباله‌های محیطی برای مثال هنگامی که کیسه‌های پلاستیکی به عنوان زباله دور ریخته می‌شوند، این کیسه‌ها به همراه باد جابه‌جا شده و وارد رودخانه‌ها و کانال‌های آب می‌شوند، در نتیجه موجب گرفتگی آبراهه‌ها شده و در بسیاری موارد به علت ساکن ماندن آب، زاد و ولد انواع حشرات افزایش می‌یابد. کیسه‌های پلاستیکی درصورت ورود به محیط زیست دریایی، وارد زنجیره غذایی جانوران دریایی شده و سالانه هزاران گونه از جانوران آبزی از قبیل وال، دلفین، فک و لاک پشت و نیز پرندگان دریایی بر اثر خوردن این کیسه‌ها و خفگی ناشی از آن می‌میرند. کیسه‌های بلعیده شده حتی پس از مرگ جانوران و تجزیه آن‌ها نیز سالم باقی می‌مانند، بنابراین دوباره پراکنده شده و از بین بردن حیاتی دیگر را ادامه می‌دهند .در نهایت وارد چرخه غذایی انسان می‌شود که در طولانی مدت، مشکلاتی را برای سلامت انسان¬ها به همراه خواهد داشت. از نظر اقتصادی رها کردن این پلاستیک‌ها و آلودگی خاکی و آبی ناشی از آن مساوی با از دست دادن آب و خاک با کیفیت مطلوب و آسیب به زیستگاه¬های طبیعی است. پلاستیک¬ها انواع مختلفی دارند یکی از پر کاربردترین انواع پلاستیک¬های سنتزی بعد از پلی اتیلن پلی‌پروپیلن است. پلی‌پروپیلن از زنجیره¬های به هم پیوسته واحدهای کربنی ساخته شده است و دارای وزن مولکولی بالایی است و در مقابل تجزیه مقاوم است. با اینکه پلاستیک¬های جنس پلی پروپیلن از دسته پلاستیک¬های پرمصرف است اما تحقیقات بسیار کمی در راستای تجزیه زیستی آن¬ها انجام شده است(17). قدرتمندترین ابزار برای تجزیه زیستی پلیمر میکروارگانیسم¬ها هستند. میکروارگانیسم¬ها توانایی خوبی برای رشد و تطابق در شرایط متفاوت و مقاومت در برابر تنش¬های محیطی دارند همین امر بر ضرورت و اهمیت این پژوهش بیش از پیش می¬افزاید. اما مساله¬ای دیگر که این پژوهش را به یک طرح کارآفرین و نوآورانه تبدیل نموده است مواردی است که در ادامه بیان شده است: با استفاده از پژوهش حاضر، می‌توان آنزیم ترشح شده توسط باکتری‌ها را استخراج نمود و پس از تجاری سازی از آن به منظور احداث مراکز تجزیه زیستی پلاستیک در کنار مراکز بازیافت استفاده کرد. از همین رو، به دست آوردن آنزیم این باکتری‌ها نوعی اشتغال¬زایی است. زیرا به افراد متخصص و کارآمدی نیاز دارد. مورد بعدی بحث بازاریابی این اکسیر حیات محیط زیست یعنی آنزیم به دست آمده است که حوزه¬های مختلفی را می¬تواند درگیر کند. این بازاریابی می¬تواند در سطح استان، کشور و یا حتی خارج از کشور صورت گیرد و با همکاری با مراکز بازیافت شهرداری هر منطقه و یا اداره محیط زیست برای تجزیه این حجم از پلاستیک در اکوسیستم¬های طبیعی (مانند آب و خاک) اقدامات قابل توجهی انجام دهد. مورد دیگر عملی کردن طرح و اضافه کردن آنزیم به پلاستیک¬های محل دفع زباله¬های پلاستیکی است که نیروی انسانی زیادی می¬طلبد و در نهایت ساخت کارخانه تولید کود‌های زیستی مخلوط با این آنزیم می‌شود که می‌تواند به پاک سازی خاک‌های آلوده به زباله‌های پلاستیکی کمک کند. تمامی موارد مطرح شده از مهم¬ترین عناوین و ایده¬های کارآفرینی این پژوهش می¬باشد. به همین دلایل، پژوهش حاضر بر آن است تا تحقیقاتی‌ را در مورد تجزیه پلاستیک¬ها (جنس پلی‌پروپیلن) با سویه‌های استاندارد انجام دهد. از این رو با توجه به این مسئله که پلاستیک فریزر از نمونه پلاستیک‌های پر مصرف مردم است و تولید پلاستیک‌های فریزر سیر صعودی داشته است در این پژوهش از این نمونه پلاستیک به عنوان نماینده پلاستیک¬های جنس پلی‌پروپیلن استفاده شد. نکته دیگری که ذهن ما را به کنجکاوی بیشتر در این مورد هدایت می‌کرد این مسئله بود که در اکثر مقالات مشابه از سویه¬های جدا شده از آب، خاک و رسوبات دریای آلوده به زباله¬های پلاستیک به منظور تجزیه زیستی پلاستیک استفاده شده است و این کار برای ما علاوه بر صرف زمان بالا هزینه¬های جداسازی سویه و طیف وسیعی از کارهای آزمایشگاهی به منظور جداسازی و تشخیص سویه¬های جدا شده با توانایی تجزیه پلاستیک را به همراه داشت به علاوه همچنان این سوال برای ما باقی می¬ماند که اگر باکتری¬ها از خاک یا آب و یا رسوبات دریایی آلوده به پلاستیک جدا نشود توانایی تجزیه پلاستیک را دارند؟ یا خیر. برای پاسخ به این سوال مهم ما از سویه¬های استاندارد به منظور توانایی تجزیه پلاستیک استفاده کردیم در واقع با این کار سویه‌های میکروبی خود را وادار کردیم که از تنها منبع انرژی موجود یعنی پلاستیک بدون داشتن تجربه تجزیه سازگار شده و به ارث رسیده از اجداد خود استفاده کنند. شاید این مسئله که بتوان از سویه¬های استاندارد با تغییر شرایط محیطی به منظور تجزیه پلاستیک استفاده کرد شروع جدیدی برای تجزیه زیستی پلاستیک با سویه¬های صنعتی در مقیاس زیاد و توان بالا باشد. روش اجرا 1-4-3-3 آماده سازی میکروارگانیسم در این پژوهش برای سنجش توانایی تجزیه زیستی پلاستیک با سویه‌های میکروبی از سه سویه استاندارد باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051و استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 و باسیلوس سرئوسATCC 11778 استفاده شد. باکتری‌های باسیلوس سوبتیلیس، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس در نوترینت آگار و نوترینت براث در شرایط هوازی و در دمای 30 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. 2-4-3-3 تهیه محیط کشت نوترینت آگار طبق دستور تهیه محیط کشت میزان 23 گرم از پودر نوترینت آگار در یک لیتر آب مقطر با گرفتن روی شعله به طور کامل حل شد. سپس در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 15 اینچ برمترمربع به مدت 20 دقیقه استریل و درنهایت درپلیت استریل درکنار شعله و در زیر هود بیولوژیک تقسیم شد. نحوه توزیع محیط‌ در پلیت‌ها به گونه‌ای بود که حجم نهایی محیط در پلیت‌ها تقریبا دو سوم حجم پلیت‌ها بود. 3-4-3-3 تهیه محیط کشت نوترینت براث طبق دستور تهیه محیط کشت میزان 23 گرم از پودر نوترینت براث در یک لیتر آب مقطر بطور کامل حل شد. سپس در اتوکلاو در دمای 121 درجه‌ی سانتیگراد و فشار 15 اینچ برمترمربع به مدت 20 دقیقه استریل و پس از رسیدن به دمای محیط، آماده‌ تلقیح باکتری شد. رسم منحنی رشد نمودار رشد باکتری‌های B.subtilis و S.aureus و B.cereus در ساعت‌های مختلف در شرایط دمایی 30 درجه سانتی گراد و دور rpm150 به صورت زیر است. نمودار شماره-3-1: منحنی رشد سه سویه B-C1: منحنی رشد باکتری باسیلوس سرئوس _ S-A1: منحنی رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس B-S1: منحنی رشد باکتری باسیلوس سوبتیلیس با توجه به منحنی رشد، باکتری‌ها از حدود 8 ساعت پس از تلقیح اولیه تا 24 ساعت پس از تلقیح در فاز لگاریتمی خود قرار دارد. این باکتری‌ها به طور میانگین در 16 تا 18 ساعت پس از تلقیح در اوج فاز لگاریتمی خود قرار دارند و بهترین زمان برای تلقیح باکتری‌ها برای تجزیه پلاستیک در این بازده زمانی است. 4-4-3-3 آماده سازی سوبسترای پلاستیک ابتدا پلاستیک‌ فریزرها نیم ساعت در آب ریکا قرار داده‌ شد. سپس 8 مرتبه با آب شهری و 3 مرتبه با آب مقطر شست و شو داده شد. بعد از مراحل شست و شو پلاستیک‌ها به مدت 48 ساعت در داخل فور قرار گرفت تا به‌طور کامل خشک شود . (نکته: برای اطمینان از خشک شدن پلاستیک‌ها، وزن پلاستیک‌ها را دو مرتبه سنجیدیم. یکسان بودن وزن پلاستیک‌‌ها در دو روز متوالی نشان دهنده خشک شدن کامل پلاستیک‌ها بود.) بعد از اینکه پلاستیک‌ها به طور کامل خشک شدند با قیچی ریز شدند و از الک آزمایشگاهی سایز مش 80 عبور داده شد تا پودری ریز و یک دست به دست آید. ساخت محیط آگار حاوی پلاستیک به منظور انجام این آزمایش ابتدا محیط آگار حاوی پلاستیک را مطابق مقادیر جدول 2 ساخته شد. جدول شماره 3-2: اجزا و مقادیر لازم جهت ساخت محیط آگار حاوی پلاستیک مقادیر اجزای محیط کشت 4 gr KH2PO4 1 gr Na2HPO4 0.25 gr MgSO4.7H2O 2 gr NaCl 0.8 ml FeCl3 %1.5 پودر آگار 1000 ml آب مقطر در مرحله اول پودرها به صورت مرحله به مرحله به بشر حاوی آب مقطر اضافه شد و بر روی استیرر قرار گرفت تا به خوبی حل شود. سپس pH بر روی 7.3 (با NaOH یک نرمال یا HCl ) تنظیم شد.( نکته: pH اولیه محیط کشت 6.8 بود. (از NaOH یک نرمال و HClرقیق شده با آب مقطر به منظور تنظیم کردن pH استفاده شد.) پس از ساخت محیط آگار مطابق با جدول 4 محیط آماده شده را در اتوکلاو در دمای 121 درجه‌ی سانتیگراد و فشار 15 اینچ برمترمربع به مدت 20 دقیقه استریل گردید. ارلن‌ها بعد از سرد شدن زیر هود بیولوژیک برده شد و در پلیت‌ها به نحوی که 3/4 هر پلیت را محیط کشت پر‌ کند، توزیع گردید. به پلیت‌ها زیر هود فرصت داده شد تا به خوبی بسته شوند. سپس با کمک پیپت پاستور استریل شده چاهک‌هایی در پلیت‌ها با فاصله برابر از مرکز زده شد و در نهایت ته چاهک‌ها با آگار 1.5% بسته شد. 5-4-3-3 نحوه انجام آزمون به منظور توانایی تجزیه پلاستیک توسط باکتری‌ها ابتدا کشت تازه‌ای از 3 باکتری باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس تهیه شد، سپس به محیط براث حاوی سوبسترا که برای هر باکتری مطابق جدول 3 تهیه شده بود منتقل گردید. بعد از گذشت 72 ساعت که در دمای 30 درجه با دور rpm 150 گرماگذاری شدند، 10 میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری، به چاهک‌های ایجاد شده در محیط آگار حاوی پلاستیک ساخته شده مطابق جدول 4 منتقل و هر 24 ساعت محیط‌ها بررسی شدند. ایجاد هاله روشن به معنای تجزیه سوبسترا و تولید آنزیم‌های لازم برای هیدرولیز پلاستیک است. در این آزمایش از آب استریل و محیط مایع حاوی پلاستیک به عنوان کنترل منفی استفاده شد. انتظار داشتیم در صورت تجزیه پلاستیک توسط باکتری، هاله تجزیه در اطراف چاهک‌ها مشاهده شود. 6-4-3-3 هیدورلیز میکروبی پلاستیک جهت انجام هیدرولیز توسط باکتری‌ها محیط کشت معدنی مطابق جدول 3 تهیه شد. جدول شماره 3-3 : مقادیر لازم جهت آماده سازی محیط کشت معدنی مقادیر اجزای محیط کشت 4 gr KH2PO4 1 gr Na2HPO4 0.25 gr MgSO4.7H2O 2 gr NaCl 0.8 ml FeCl3 1000 ml آب مقطر 100 میلی‌لیتر از محلول سنتزی ساخته شده به کمک استوانه مدرج اندازه گیری و داخل ارلن‌ها ریخته شد. دقیقاً 0.1 گرم پلاستیک وزن کرده و به هر ارلن اضافه شد. سپس سر ارلن‌ها با پنبه و فویل بسته شد و داخل اتوکلاو در دمای 121 درجه‌ی سانتیگراد و فشار 15 اینچ برمترمربع به مدت 20 دقیقه استریل گردید. بعد از 15 دقیقه ارلن‌ها از اتوکلاو خارج و در دمای محیط سرد شد. دور ارلن‌ها الکل زده شد. بعد با احتیاط زیر هود برده و cc4 از هر باکتری که قبلا غلظت نیم مک فارلندشان آماده شده بود، داخل ارلن‌ها ریخته شد و مشخصات هر باکتری را روی ارلن‌ها نوشته و سپس داخل انکوباتور در دمای 30 درجه با دور rpm 150 به مدت 20 روز قرار داده شد. 7-4-3-3 سنجش درصد از دست دادن وزن پلاستیک در طی تخمیر به منظور سنجش درصد هیدرولیز پلاستیک بعد از پایان دوره گرماگذاری، نمونه‌های داخل هر ارلن از کاغذ صافی شماره واتمن 1 عبور داده و چندین مرتبه با آب مقطر شست و شو داده شد. سپس نمونه‌ها همراه با کاغذ صافی در فور گذاشته شد و پس از 72 ساعت وزن نمونه‌ها همراه با کاغذ صافی اندازه گیری شد. (در ابتدای کار وزن کاغذ صافی اندازه‌گیری شد و ‌‌‌‌از وزن اندازه‌گیری شده پس از 72 ساعت کم شد) به منظور سنجش درصد از دست دادن وزن پلاستیک در طی بیست روز تخمیر، وزن‌های به دست آمده در فرمول 3-1 گذاشته شد(7). درصد از دست دادن وزن پلاستیک = (اولیه وزن _ ثانویه وزن )/((اولیه وزن ) کل وزن )×100 مانده باقی پلاستیک وزن=نهایی وزن _ (اولیه پلاستیک وزن+صافی کاغذ وزن ) یافته ها -4-3 آزمون توانایی تجزیه پلاستیک: به منظور اثبات توانایی تجزیه پلاستیک توسط سه سویه میکروبی مورد پژوهش از روش چاهک پلیت مطابق دستورالعمل گفته شده استفاده شد. بعد از گذشت 72 ساعت از زمان گرماگذاری نتایج به دست آمده به صورت زیر بود: شکل شماره 4-1: هاله‌ی تجزیه باکتری باسیلوس سرئوس ATCC 11778 در شکل شماره 1 دو چاهک شاهد و چاهک تجزیه نشان داده شده است همان طور که مشاهده می‌کنید هاله‌ای پراکنده در اطراف چاهک تجزیه باکتری باسیلوس سرئوس دیده می‌شود اما در اطراف چاهک شاهد که فاقد باکتری است هیچ هاله‌ای دیده نمی‌شود. شکل شماره 4-2: هاله‌ی تجزیه باکتری باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051 در شکل شماره 2 چاهک تجزیه حاوی باکتری باسیلوس سوبتیلیس و چاهک شاهد فاقد باکتری به خوبی نشان داده شده است هاله پراکنده زرد رنگی نسبت به چاهک شاهد در اطراف چاهک تجزیه دیده می‌شود. شکل شماره 4-3: هاله‌ی تجزیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 25923 در شکل شماره 3 هاله تجزیه حاصل از رشد و یا فعالیت باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به خوبی پیداست. در بین سه سویه مورد پژوهش هاله حاصل از این سویه بهتر دیده می‌شود. این هاله دیده شده در هر سه تصویر احتمالا به دلیل رشد سه سویه و در نتیجه استفاده آن‌ها از تنها منبع کربن محیط یعنی پلاستیک است. الگوهای متفاوت رشد و تجزیه پلاستیک توسط باکتری‌ها احتمالا دلیلی بر تفاوت شکل ظاهری هاله‌ها است. کشت سه روزه‌ای که قبل از این مرحله انجام شد در واقع با این هدف بود که باکتری به محیط کشت حاوی پلاستیک به عنوان منبع کربن سازگار شود و آنزیم‌های لازم را در محیط براث(مایع) که به نسبت از محیط آگار(جامد) به دلیل هوادهی بیشتر شرایط مناسب تری برای رشد باکتری‌ها و تولید آنزیم‌های لازم را دارد فراهم شود و سپس به محیط جامد حاوی سوبسترا اضافه شود. در اطراف چاهک شاهد که در اینجا محیط کشت فاقد باکتری است، هیچ هاله‌ای مشاهده نشده است. مشاهده هاله در اطراف چاهک‌های حاوی باکتری به عنوان شاهدی است که نشان می‌دهد سویه‌ها از پلاستیک‌ها استفاده کرده‌اند. نمودار شماره 4-1: نمودار تجزیه پلاستیک Control: نمونه شاهد حاوی محیط کشت فاقد باکتری، S-A m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، B-C m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری باسیلوس سرئوس.B-S m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری باسیلوس سوبتیلیس 2-4-3 بررسی تغییرات وزنی پلاستیک در اثر تجزیه پس از پایان دوره گرماگذاری بیست روزه مطابق روش سنجش درصد از دست دادن وزن پلاستیک که در قسمت‌های قبلی ذکر شده است وزن پلاستیک‌های باقی مانده پس از شست و شو و خشک شدن در سه محیط تخمیری و کنترل بررسی شد و با توجه به فرمول ذکر شده درصد تجزیه سنجیده شد.تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شد. با توجه به نمودار5 می‌توان نتیجه گرفت هر سه سویه در هیدرولیز پلاستیک موفق بوده‌اند و نسبت به محیط کنترل فاقد باکتری میزان بیشتری از پلاستیک هیدرولیز شده است. اختلاف درصد تجزیه بین محیط کنترل و محیط استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 معنادار است (P= 0.000127504). این افزایش درصد تجزیه احتمالا به دلیل افزایش میزان آنزیم‌های تجزیه کننده پلاستیک و استفاده از پلاستیک به عنوان منبع کربن است. به علاوه نمودار به خوبی نشان می‌دهد که اختلاف معناداری در درصد تجزیه بین محیط کنترل و محیط حاوی باسیلوس سرئوس ATCC 11778 به عنوان باکتری تجزیه کننده (P=5.55139×〖10〗^(-5)) و باکتری باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051 و محیط کنترل (P=1.33677×〖10〗^(-5)) وجود دارد. 3-4-3 بررسی مورفولوژی پلاستیک مقایسه شکل ظاهری پلاستیک‌های تجزیه شده با نمونه‌های شاهد تغییر چشمی قابل مشاهده‌ای را نشان نداد. به همین منظور از میکروسکوپ الکترونی روبشی(SEM) برای مقایسه تغییرات ساختار سطحی نمونه‌های تجزیه شده با شاهد استفاده شد. پلاستیک‌های تحت هیدرولیز میکروبی بعد از 20 روز گرماگذاری با کمک کاغذ صافی از محیط کشت جدا شد سپس سه مرتبه با آب مقطر شسته شد و پس از خشک شدن به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه الزهرا تهران جهت عکس برداری ارسال شد. در شکل شماره 4 نمایی از تصاویر گرفته شده با میکروسکوپ SEM نشان داده شده است. شکل شماره 4-4: برسی مورفولوژی پلاستیک بامیکروسکوپ SEM A: نمونه شاهد(کنترل)_ B: استافیلوکوکوس اورئوس_ C: باسیلوس سوبتیلیس _ D: باسیلوس سرئوس همان طور که در شکل A می¬بینید نمونه شاهد دارای ظاهری صاف بدون هیچ چاله، ترک و یا ذره¬های متصل در سطح است. در حالی که در پلاستیک¬های هیدرولیز شده با سویه¬های استافیلوکوکوس اورئوس در شکل B چندین ترک در سطح ایجاد شده و یا در نمونه هیدرولیز شده با باکتری باسیلوس سوبتیلیس در شکل C حفره‌ها و چاهک‌های متعددی در سطح نمونه ایجاد شده و یا در نمونه باسیلوس سرئوس در شکل D بی¬نظمی¬هایی که در نتیجه فعالیت میکروبی است تشکیل شده است این تغییرات سطحی مشاهده شده نشان دهنده آسیب سطحی به پلیمرهای پلی پروپیلن در نتیجه هیدرولیز میکروبی در طی بیست روز دوره تخمیر بود. شکل شماره 4-5: برسی مورفولوژی پلاستیک در مناطق اتصال باکتری با میکروسکوپ SEM A: نمونه شاهد(کنترل)_ B: استافیلوکوکوس اورئوس_ C: باسیلوس سوبتیلیس _ D: باسیلوس سرئوس شکل 5 به خوبی اتصال باکتری¬ها به سطح پلاستیک مشخص است که نشان دهنده قابلیت اتصال قوی و همچنین استفاده این سویه¬ها از پلی پروپیلن به عنوان تنها منبع انرژِی موجود در محیط کشت است شکل گیری اجتماع‌های میکروبی احتمالا منجر به ترشح آنزیم‌های خارج سلولی(برون ریز) توسط سویه‌ها می‌شود. این آنزیم‌ها به سویه‌ها کمک می‌کنند که حفره‌ها و ترک‌ها و بی نظمی‌های بیشتری در سطح نمونه ایجاد کنند و باکتری به این منافذ و ترک‌ها بیشتر وارد شود و یا به بی¬نظمی¬ها متصل شود و به مرور زمان منجر به تضعیف پیوندهای پلی پروپیلن و فرسایش و تجزیه زیستی پلاستیک شوند. بحث و نتیجه گیری بحث و نتیجه گیری در واقع در این پژوهش درصد از دست دادن وزن پلاستیک به عنوان معیاری برای سنجش درجه هیدرولیز پلاستیک مورد بررسی قرار گرفت. مشاهده درصد تجزیه پلاستیک به مقدار ناچیز در محیط شاهد احتمالا به دلیل تاثیر املاح نمکی موجود در محیط کشت پایه بر روی پلاستیک بوده است. به دلیل ناچیز بودن این مقادیر در اعلام درصد تجزیه نهایی پلاستیک توسط سویه‌های مورد بررسی از تاثیر محیط بر روی پلاستیک صرف نظر شد. علاوه بر این مسئله هیچ نشانه‌ای از تغییر سطحی پلاستیک درمحیط کنترل دیده نمی‌شود. باکتری باسیلوس سرئوس ATCC 11778 توانایی تجزیه 26.7% پلاستیک اولیه و باکتری باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051 توانایی تجزیه 31% پلاستیک اولیه را و باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 توانایی تجزیه 19.4% پلاستیک را داشت. در جدول شماره 4 به مقایسه درصد تجزیه پلی پروپیلن در پژوهش حاضر با سایر پژوهش‌ها پرداخته شده است. جدول شماره5-1: مقایسه درصد تجزیه پلی‌پروپیلن در مقالات مشابه درصد تجزیه نام سویه مدت زمان تخمیر محل جداسازی نام پژوهشگران 12% باسیلوس سرئوس 40 روز از خاک هلن و همکاران 11% اسپورسارسینا گلوبیزپورا 4% رودوکوکوس رابر 28 روز رسوبات دریایی آتو و همکاران 6.4% باسیلوس سوبتیلیس 20.3% استنوترفوموناس پاناچئومیPA3-2 90 روز از خاک جئون و همکاران 1.7% لاسیودیپلودیا تئوبرومائه 90 روز از گیاهان شیک و همکاران 31% باسیلوس سوبتیلیس 20 روز خریداری شده پژوهش حاضر 26.7% باسیلوس سرئوس 20 روز خریداری شده پژوهش حاضر 19.4% استافیلوکوکوس اورئوس 20 روز خریداری شده پژوهش حاضر همان طور که مشاهده می‌کنید درصد تجزیه در پژوهش حاضر نسبت به سایر پژوهش‌ها بالاتر بوده است (باسیلوس سوبتیلیس31%). علاوه بر درصد قابل قبول تجزیه پلاستیک در پژوهش حاضر نسبت به سایر پژوهش‌ها مدت زمان گرماگذاری به منظور تجزیه زیستی پلاستیک در این تحقیق کم‌تر از سایر پژوهش‌ها بوده است. به علاوه نتایج بررسی مورفولوژی با میکروسکوپ SEM به خوبی تغییرات سطحی در سطح پلیمر پلاستیک را نشان می¬دهد و شاهد محکمی برای تجزیه زیستی پلاستیک در این پژوهش است. نکته قابل توجه بیان این مسئله است که مقدار سوبسترا، نوع سوبسترا، pH اولیه محیط کشت، املاح نمکی و ترکیبات محیط کشت، دمای گرماگذاری و حتی منابع کمکی کربن و نیتروژن نیز در مقدار تولید آنزیم‌های تجزیه کننده پلاستیک و در نتیجه تجزیه پلاستیک موثراست. در این پژوهش مقدار سوبسترا، دما، pH اولیه محیط کشت و املاح نمکی و ترکیبات محیط کشت هنوز بهینه نگردیده است و صرفاً شرایط پایه برای تولید آنزیم‌های تجزیه کننده پلاستیک ایجاد شد. حتی از اضافه کردن ترکیبات کمکی معمول در تمام پژوهش‌ها مانند عصاره مخمر و پپتون نیز صرف نظر شد. این نکته شاید به عنوان یکی از نکات اقتصادی این پژوهش به حساب می‌آید به علاوه اجبار باکتری‌ها برای مصرف پلاستیک به عنوان تنها منبع کربن احتمالا دلیلی برای تولید آنزیم‌های لازم برای تجزیه پلاستیک است. انتخاب متفاوت دیگر در این پژوهش انتخاب میکروارگانیسم‌ها است در بیشتر مقالات مشابه اکثر سویه‌های جداشده با هدف تجزیه پلاستیک از زباله‌های پلاستیکی، خاک و خاک آمیخته با پلاستیک در محل دفع زباله‌ها جدا گردید (اما در این پژوهش سویه‌های استاندارد انتخاب گردید). بسیاری از گونه‌های مختلف باکتری که در تجزیه پلاستیک‌ها نقش دارند متعلق به جنس باسیلوس هستند به همین دلیل در این مقاله از دو سویه باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس استفاده شد و به منظور سنجش توانایی تجزیه پلاستیک فریزر (جنس پلی پروپیلن) توسط سویه استافیلوکوکوس از سویه استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 به منظور تجزیه پلاستیک استفاده گردید. به طور کلی نتایج به دست آمده نشان داد که این سه سویه توانایی بسیار خوبی در تجزیه پلاستیک دارند. این پژوهش شروعی جدید برای استفاده از سوش‌های استاندارد و استخراج آنزیم‌های ترشح شده توسط این باکتری‌ها و بهینه سازی شرایط تولید آنزیم و رشد باکتری برای تجزیه پلاستیک‌های جنس پلی پروپیلن است.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها -4-3 آزمون توانایی تجزیه پلاستیک: به منظور اثبات توانایی تجزیه پلاستیک توسط سه سویه میکروبی مورد پژوهش از روش چاهک پلیت مطابق دستورالعمل گفته شده استفاده شد. بعد از گذشت 72 ساعت از زمان گرماگذاری نتایج به دست آمده به صورت زیر بود: شکل شماره 4-1: هاله‌ی تجزیه باکتری باسیلوس سرئوس ATCC 11778 در شکل شماره 1 دو چاهک شاهد و چاهک تجزیه نشان داده شده است همان طور که مشاهده می‌کنید هاله‌ای پراکنده در اطراف چاهک تجزیه باکتری باسیلوس سرئوس دیده می‌شود اما در اطراف چاهک شاهد که فاقد باکتری است هیچ هاله‌ای دیده نمی‌شود. شکل شماره 4-2: هاله‌ی تجزیه باکتری باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051 در شکل شماره 2 چاهک تجزیه حاوی باکتری باسیلوس سوبتیلیس و چاهک شاهد فاقد باکتری به خوبی نشان داده شده است هاله پراکنده زرد رنگی نسبت به چاهک شاهد در اطراف چاهک تجزیه دیده می‌شود. شکل شماره 4-3: هاله‌ی تجزیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 25923 در شکل شماره 3 هاله تجزیه حاصل از رشد و یا فعالیت باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به خوبی پیداست. در بین سه سویه مورد پژوهش هاله حاصل از این سویه بهتر دیده می‌شود. این هاله دیده شده در هر سه تصویر احتمالا به دلیل رشد سه سویه و در نتیجه استفاده آن‌ها از تنها منبع کربن محیط یعنی پلاستیک است. الگوهای متفاوت رشد و تجزیه پلاستیک توسط باکتری‌ها احتمالا دلیلی بر تفاوت شکل ظاهری هاله‌ها است. کشت سه روزه‌ای که قبل از این مرحله انجام شد در واقع با این هدف بود که باکتری به محیط کشت حاوی پلاستیک به عنوان منبع کربن سازگار شود و آنزیم‌های لازم را در محیط براث(مایع) که به نسبت از محیط آگار(جامد) به دلیل هوادهی بیشتر شرایط مناسب تری برای رشد باکتری‌ها و تولید آنزیم‌های لازم را دارد فراهم شود و سپس به محیط جامد حاوی سوبسترا اضافه شود. در اطراف چاهک شاهد که در اینجا محیط کشت فاقد باکتری است، هیچ هاله‌ای مشاهده نشده است. مشاهده هاله در اطراف چاهک‌های حاوی باکتری به عنوان شاهدی است که نشان می‌دهد سویه‌ها از پلاستیک‌ها استفاده کرده‌اند. نمودار شماره 4-1: نمودار تجزیه پلاستیک Control: نمونه شاهد حاوی محیط کشت فاقد باکتری، S-A m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، B-C m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری باسیلوس سرئوس.B-S m+p+b نمونه حاوی محیط کشت حاوی باکتری باسیلوس سوبتیلیس 2-4-3 بررسی تغییرات وزنی پلاستیک در اثر تجزیه پس از پایان دوره گرماگذاری بیست روزه مطابق روش سنجش درصد از دست دادن وزن پلاستیک که در قسمت‌های قبلی ذکر شده است وزن پلاستیک‌های باقی مانده پس از شست و شو و خشک شدن در سه محیط تخمیری و کنترل بررسی شد و با توجه به فرمول ذکر شده درصد تجزیه سنجیده شد.تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شد. با توجه به نمودار5 می‌توان نتیجه گرفت هر سه سویه در هیدرولیز پلاستیک موفق بوده‌اند و نسبت به محیط کنترل فاقد باکتری میزان بیشتری از پلاستیک هیدرولیز شده است. اختلاف درصد تجزیه بین محیط کنترل و محیط استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 معنادار است (P= 0.000127504). این افزایش درصد تجزیه احتمالا به دلیل افزایش میزان آنزیم‌های تجزیه کننده پلاستیک و استفاده از پلاستیک به عنوان منبع کربن است. به علاوه نمودار به خوبی نشان می‌دهد که اختلاف معناداری در درصد تجزیه بین محیط کنترل و محیط حاوی باسیلوس سرئوس ATCC 11778 به عنوان باکتری تجزیه کننده (P=5.55139×〖10〗^(-5)) و باکتری باسیلوس سوبتیلیس ATCC 6051 و محیط کنترل (P=1.33677×〖10〗^(-5)) وجود دارد. 3-4-3 بررسی مورفولوژی پلاستیک مقایسه شکل ظاهری پلاستیک‌های تجزیه شده با نمونه‌های شاهد تغییر چشمی قابل مشاهده‌ای را نشان نداد. به همین منظور از میکروسکوپ الکترونی روبشی(SEM) برای مقایسه تغییرات ساختار سطحی نمونه‌های تجزیه شده با شاهد استفاده شد. پلاستیک‌های تحت هیدرولیز میکروبی بعد از 20 روز گرماگذاری با کمک کاغذ صافی از محیط کشت جدا شد سپس سه مرتبه با آب مقطر شسته شد و پس از خشک شدن به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه الزهرا تهران جهت عکس برداری ارسال شد. در شکل شماره 4 نمایی از تصاویر گرفته شده با میکروسکوپ SEM نشان داده شده است. شکل شماره 4-4: برسی مورفولوژی پلاستیک بامیکروسکوپ SEM A: نمونه شاهد(کنترل)_ B: استافیلوکوکوس اورئوس_ C: باسیلوس سوبتیلیس _ D: باسیلوس سرئوس همان طور که در شکل A می¬بینید نمونه شاهد دارای ظاهری صاف بدون هیچ چاله، ترک و یا ذره¬های متصل در سطح است. در حالی که در پلاستیک¬های هیدرولیز شده با سویه¬های استافیلوکوکوس اورئوس در شکل B چندین ترک در سطح ایجاد شده و یا در نمونه هیدرولیز شده با باکتری باسیلوس سوبتیلیس در شکل C حفره‌ها و چاهک‌های متعددی در سطح نمونه ایجاد شده و یا در نمونه باسیلوس سرئوس در شکل D بی¬نظمی¬هایی که در نتیجه فعالیت میکروبی است تشکیل شده است این تغییرات سطحی مشاهده شده نشان دهنده آسیب سطحی به پلیمرهای پلی پروپیلن در نتیجه هیدرولیز میکروبی در طی بیست روز دوره تخمیر بود. شکل شماره 4-5: برسی مورفولوژی پلاستیک در مناطق اتصال باکتری با میکروسکوپ SEM A: نمونه شاهد(کنترل)_ B: استافیلوکوکوس اورئوس_ C: باسیلوس سوبتیلیس _ D: باسیلوس سرئوس شکل 5 به خوبی اتصال باکتری¬ها به سطح پلاستیک مشخص است که نشان دهنده قابلیت اتصال قوی و همچنین استفاده این سویه¬ها از پلی پروپیلن به عنوان تنها منبع انرژِی موجود در محیط کشت است شکل گیری اجتماع‌های میکروبی احتمالا منجر به ترشح آنزیم‌های خارج سلولی(برون ریز) توسط سویه‌ها می‌شود. این آنزیم‌ها به سویه‌ها کمک می‌کنند که حفره‌ها و ترک‌ها و بی نظمی‌های بیشتری در سطح نمونه ایجاد کنند و باکتری به این منافذ و ترک‌ها بیشتر وارد شود و یا به بی¬نظمی¬ها متصل شود و به مرور زمان منجر به تضعیف پیوندهای پلی پروپیلن و فرسایش و تجزیه زیستی پلاستیک شوند.

فایل های پژوهش