پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مسرطان در اکثر کشورهای جهان دومین یا سومین عامل مرگ و میر محسوب می گردد و پیش بینی کرده اند که میزان بروز آنان تا سال ۲۰۲۰ سالانه به ۱۵ میلیون نفر خواهد رسید. داروهای سیتوتوکسیک مورد استفاده در درمان هر چند موفقیت های قابل توجهی در سیر پیشرفت درمان ایجاد کرده است اما عوارض جانبی آنها از علل مهم مرگ و میر بیماران است . ترکیبات مشتق از گیاهان اخیراً از جهت اثرات سیتوتوکسیک و نیز بازدارنده از ابتلا به سرطان مورد توجه قرار گرفته اند . یکی از اهداف درمانهای ضد سرطان و دارویی القاء اپوپتوز در سلولهاست. یک ترکیب پلی فنولی چای سبز epigallocatechin gallate (EGCG) خواص ضد میتوزی و ضد سرطان زایی دارد. دوز موثر EGCG بر روی سلولهای لوسمیک لنفوبلاستی و نیز تغییرات اپوپتوتیک در این سلول ها و بیان IL۲و اثرات آن به صورت ادجوانت در ترکیب با داروهای روتین مورد استفاده در شیمی درمانی از مواردی است که می تواند مورد توجه قرار گیرد . هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر EGCG مشتق از چای سبز به صورت مجزا ونیز همراه با داروی شایع مورد استفاده در درمان لوسمی های لنفوبلاستیک حاد اسپاراژیناز بر رده سلولی C۱۲۱می باشد . مراحل :۱- کشت:سلول ها درمحی ط RPMI ۱۶۴۰ که حاوی ۱۰ سرم جنین گاو، پنی سیلین(۱۰۰ Ml/u)، استرپتومایسین (۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر)، گلوتامین (۳ ml/mg)، پیرویک اسید ( (۲، ( ۰/۱۱ ml/mg – مرکاپتواتانول ۲- ME و ۰/۳۷) NAHCO۳%) است کشت داده می شوند و در انکوباتور ۳۷سانتی گراد با ۵ CO۲ و رطوبت ۹۸ نگهداری می شود. غلظت های مختلف EGCG مشتق از چای سبز (۲۰,۳۰, ۶۰,۴۰می کروگرم/می لی لی تر)در DMSO حل شده وبه صورت مجزا و همراه باداروی شی می درمانی اسپارژی نازبه سلول های محیط های کشت اضافه می شوند . به عنوان کنترل در محیط کشت سلولی DMSO به تنهایی اضافه می گردد(۲۷).    ۲- آزمایش پرولیفراسیون سلولی با روش MTS: آزمایش پرولیفراسیون سلولی با روش MTSانجام می گیرد. ۱۰۰ میکرولیتر از محیط حاوی ۵۰۰۰ سلول از رده سلولی c۱۲۱در میکرو پلیت ۹۶ خانه ای کشت داده می شوند. سلول های با غلظت های مختلف مورد نظر ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور CO۲ با ۹۸ رطوبت کشت داده می شود. سپس این محیط با ۱۰۰ میکرو لیتر محیط تازه و ۲۰ میکرو لیتر از محلول MTS به مدت ۱ تا ۴ ساعت   انکوبه می گردد. جدب نوری در طول موج ۴۹۰ نانومتر اندازه گیری می شود. جذب نوری متناسب با تعداد سلول های زنده در محیط کشت است. میزان تکثیر سلولی با مقایسه جذب سلول های مختلف و کنترل بررسی می گردد و IC۵۰     در هر مورد تعیین می گردد.    ۳- بررسی بیان ژن IL۲در سلول های مجاور شده با دارو ها با روش Rt-PCR :درابتدا RNA سلول های ی که در زمان های ,۴,۶۲ساعت در محیط کشت سلول در مجاورت غلظت IC۵۰ از ترکیبات مورد نظرقرار گرفته اند را با استفاده از کیت مربوط به استخراج RNAاستخرج نموده وپس از استخراج RNA نمونه ها را Qliquot نموده و RNA total را سنجش نموده و تا جمع آوری کل نمونه ها، آن ها را در فریزر (۷۰-) قرار میگیرد.اندازه گیری میزان Total RNA:با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر میزان Total RNA اندازه گیری شود. برای این کار RNA به نسبت ۱ به ۱۰۰ با آب مقطر رقیق شده در طول موج های ۲۸۰، ۲۶۰، ۳۲۰ میزان جذب آن قرائت شده می شود. با استفاده از فرمول زیر میزان ‌ RNAمحاسبه می گردد.Total RNA= (OD ۲۶۰ _ OD۳۲۰) * ۴۰*۱۰۰ساختن :CDNA۵میکروگرم از RNA با استفاده از کیت Revert Aid First CDNA Synthesis به CDNAتبدیل می شود. به منظور جلوگیری از آلودگی با DNA ژنومیک قبل از ساختن CDNA از آنزیم DNASEI استفاده می شود. انجام Real – Time PCRاستفاده از PCR Master mix Taq- manprobe RNA سایتوکاینIL۲ از سلول های کشت داده شده و مجاور شده با داروها تکثیر می شود و بیان m RNA هر ژن نسبت به ژن رفرانس(β اکتین) محاسبه می شود.    ۴ - Caspase Assay : سلول ها مانند مرحله ی ۱ کشت داده می شود و سپس مانند مرحله ی ۲ با دارو های مورد نظر در IC۵۰ تعیین شده مجاور گشته و از کیت Apo-one Homogenous Caspase ۳/۷ assay برای تعیین فعالیت کاسپاز ها استفاده می شود و باplate reader در طول موج ۴۰۵ نانومتر نتایج بررسی می شود و نسبت به کنترل سنجیده می شود.

خلاصه نتایج حاصله

ه منظور جلوگیری از آلودگی با DNA ژنومیک قبل از ساختن CDNA از آنزیم DNASEI استفاده می شود. انجام Real – Time PCRاستفاده از PCR Master mix Taq- manprobe RNA سایتوکاینIL۲ از سلول های کشت داده شده و مجاور شده با داروها تکثیر می شود و بیان m RNA هر ژن نسبت به ژن رفرانس(β اکتین) محاسبه می شود.    ۴ - Caspase Assay : سلول ها مانند مرحله ی ۱ کشت داده می شود و سپس مانند مرحله ی ۲ با دارو های مورد نظر در IC۵۰ تعیین شده مجاور گشته و از کیت Apo-one Homogenous Caspase ۳/۷ assay برای تعیین فعالیت کاسپاز ها استفاده می شود و باplate reader در طول موج ۴۰۵ نانومتر نتایج بررسی می شود و نسبت به کنترل سنجیده می شود.

فایل های پژوهش