پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله بر اساس آمارهای موجود 35 درصد موارد ناباروری مربوط به مردان و 40 درصد ناباروری مربوط به خانم‌ها می باشد. شایعترین علت ناباروری مردان عدم توانایی آنان در تولید تعداد کافی اسپرم¬های سالم و فعال است (1-3). در خلال چند دهه گذشته کیفیت مایع اسپرمی و قدرت باروری در جوامع بشری به طور چشم گیری کاهش یافته است. این امر نشانگر آن است که کیفیت مذکور دستخوش تغییراتی شده که ریشه در عوامل سمی موجود در محیط زیست انسان¬ها داشته که مواردی همچون مسمومیت با انواع مواد مخدر، دخانیات و مواد شیمیایی و قرارگیری در معرض تشعشعات زمینه¬ای، پزشکی یا نظامی از آن جمله می¬باشد (3). 3-1-1-دستگاه تولیدمثل مذکر و عوامل موثر بر باروری دستگاه تولیدمثل مرد شامل بیضه¬ها، مجاری تناسلی، غدد ضمیمه و آلت تناسلی است. هر بیضه توسط کپسولی از جنس بافت همبند متراکم به نام پرده سفید (tunica albuginea) احاطه شده که در سطح خلفی بیضه ضخیم شده و مدیاستینوم بیضه (testis mediastinum) را تشکیل می¬دهد. از این ناحیه دیواره¬هایی به درون بیضه نفوذ کرده و آن را به حدود 250 بخش هرمی به نام لوبول بیضه¬ای (testicular lobule) تقسیم می¬کنند (4, 5). هر لوبول دارای بافت همبند سست، سلول¬های اندوکرین بینابینی به نام سلول لیدیگ (leydig cells) و 4 لوله منی¬ساز (seminiferous tubules) بسیار پیچ¬خورده است. سلول¬های لیدیگ هورمون تستوسترون را تحت تاثیر هورمون لوتئینی کننده (LH) مترشحه از غده هیپوفیز ترشح می¬کنند و لوله-های منی¬ساز اسپرم را تولید می¬کنند (4-6). اسپرم حاوی نیمی از کروموزوم‌های (هاپلوئید) موجود در سلول‌های سوماتیک است (4). اسپرم بصورت غیرفعال لوله‌های منی‌ساز را پشت سر گذاشته و از لحاظ عملکردی در اپیدیدیم بالغ می‌شود. عواملی که بر سلامت DNA اثر می¬گذارند به دو دسته عوامل اندوژن و اگزوژن تقسیم می¬شوند. عوامل اگزوژن عبارتند از عوامل محیطی که شامل عوامل اجتماعی و شیمیایی است. به طور خلاصه می توان عوامل محیطی را به زیر گروه هایی چون عوامل اجتماعی (سوء مصرف الکل و اعتیاد به مواد مخدر) عوامل شیمیایی (مواجهات شغلی، مواجهه با سرب و سایر فلزات سنگین، مواجهه مستمر با گرما، داروها، شیمی¬درمانی و رادیوتراپی، افزایش سن و ژنتیک افراد) تقسیم بندی کرد (7, 8). 3-1-2-سیکلوفسفامید و ویژگی¬های آن سیکلوفسفامید یک داروی ضد سرطان است که در بدن به یک متابولیت فعال آلکیله کننده تبدیل می‌گردد و یک جز اساسی و مهم در بسیاری از ترکیبات دارویی موثر می‌باشد. سیکلوفسفامید به راحتی از دستگاه گوارش جذب می‌گردد و به طور گسترده در بافت‌ها و مایعات بدن توزیع می‌گردد و در کبد به متابولیت‌های فعال تبدیل شده و سرانجام از طریق کلیه‌ها دفع می‌گردد (9). سیکلوفسفامید به گروه داروهای سیتوتوکسیک (آلکیله کننده) تعلق دارد که تحت تاثیر آنزیم‌های کبدی به متابولیت‌های فعال فسفرآمید موستارد و آکرلیین تبدیل می‌شود. فسفرآمید موستارد مسئول خواص ضدسرطانی سیکلوفسفامید است اما آکرولیین با تداخل در سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی بافت‌ها و تولید مقدار زیادی رادیکال آزاد اکسیژن دارای خواص موتاژنی است. سیکلوفسفامید دارویی پرمصرف در درمان سرطان است که اولین بار در سال 1958 تولید شد و نمونه اولیه آن اکسازافسفرین بدون عمل آلکیله کننده مستقیم بود. آن یک پیش دارو از غیرموستاردها است که به تغییرات زیستی نیاز دارد تا به متابولیت‌های فعال تبدیل شود (10). مکانیسم اثر این دارو به طور عمده ناشی از ایجاد اتصال بین دو و همچنین مهار RNA و نیز DNA و شکستن DNA رشته مولکولی سنتز پروتیین است. اثرات آنتی‌نئوپلاستیکی سیکلوفسفامید مربوط به فسفورآمید موستارد است. در حالیکه آکرولین از طریق تداخل با سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی بافت‌ها تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن کرده و مسئول پیدایش اثرات سمی مانند مرگ سلولی، آپوپتوز، تشکیل تومورهای گوناگون و نکروز می‌باشد. دو هدفی که در سنتز داروهای شیمی‌درمانی در نظر می‌گیرند این است که دارو علاوه بر اینکه جنبه سایتوتوکسیکی داشته و سلول‌های سرطانی را از بین ببرد بر سلول‌های سالم فرد بیمار نیز کمترین تأثیر را داشته باشد (10, 11). استفاده از داروهای شیمی درمانی و همچنین رادیوتراپی اثرات قابل توجهی بر گنادهای مردانه دارد. بیشتر این دارو‌ها آلکیله کننده‌های سلولی هستند. بیشتر مردانی که از این دارو برای درمان لنفوما استفاده کرده بودند دچار ناباروری شدند که دلیل آن هم حساسیت بالای سلول‌های Germ cell تولید کننده اسپرماتوگونی است (12). بدلیل حساسیت فرآیند اسپرماتوژنز به سیکلوفسفامید، مصرف این دارو باعث افت تعداد اسپرم می‌شود. سیکلوفسفامید به تنهایی نمی تواند که سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی مربوط به اسپرماتوژنز را از بین ببرد اما باعث آسیب سلولی و تخریب در خود سلول‌های اسپرماتوگونی می‌شود (13). علیرغم کاربردهای کلینیکی فراوان، این دارو اثرات مخربی مانند سمیت دستگاه تناسلی در انسان‌ها و حیوانات آزمایشگاهی که در معرض این دارو قرار می‌گیرند، دارد (14). مکانیسم عمل سیکلوفسفامید در ایجاد اختلالات بیضوی هنوز به طور کامل شناخته نشده است؛ اما مطالعات متعددی نشان می‌دهند که سیکلوفسفامید قادر به بر هم زدن واکنش های احیاگر در بافت¬ها است. اختلالات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی بوجود آمده، حاصل افزایش میزان استرس اکسیداتیو است (15). اثرات آنتی نئوپلاستیکی سیکلوفسفامید مربوط به فسفورآمیدموستارد است، اما تولید رادیکال‌های آزاد ناشی از تداخل آکرولین با سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی است و مسئول پیدایش اثرات سمی مانند آپوپتوز، تشکیل تومورهای متعدد و نکروز است (16). ترکیبات بیولوژیک با خواص آنتی اکسیدانی قادرند که سلول‌ها و بافت‌ها را در برابر اختلالات حاصل از گونه‌های فعال اکسیژن و رادیکال‌های آزاد محفاظت کنند (17, 18). بنابراین تجویز آنتی اکسیدانها در طول شیمی درمانی به منظور کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از تجویز سیکلوفسفامید و سم زدایی بافتها ضروری به نظر می رسد. تارگت اصلی فعالیت ضد سرطانی سیکلوفسفامید، DNA است (19). البته سلول‌های اسپرماتوژنیک نیز به دلیل فعالیت تقسیم میتوزی بالایشان مورد هدف این دارو قرار می‌گیرند. اساس بیوشیمیایی سمیت سیکلوفسفامید مربوط به تولید رادیکال‌های آزاد و گونه‌های اکسیژن فعال در بافت‌ها می‌باشد که هرگاه به مقدار زیادی تولید شود، موجب فراگمنتاسیون DNA و از دست رفتن عملکرد طبیعی اسپرم در ارتباط با آسیب پراکسیداتیو به میتوکندری و غشاء اسپرم می‌شود (11). مکمل‌های آنتی¬اکسیدانی و غذاهای سرشار از آنتی¬اکسیدان می‌توانند آسیب‌های اکسیداتیو را با کاهش رادیکال‌های آزاد و اکسیژن‌های فعال در بدن انسان کاهش دهند (20). 3-1-3- شیرین بیان گیاه شیرین بیان (Glycyrrhiza glabra) یکی از گیاهان دارویی می‌باشد که به مقدار فراوان در جهان استفاده می‌شود. این گیاه بومی نواحی جنوب اروپا-آسیا و مدیترانه است. براساس یادشت های تاریخی به جا مانده از افلاطون، یونانیان احتمالا نخستین بار از گیاه شیرین بیان در زمینه پزشکی استفاده کردند و آنرا سکاهین (Scythian) نامیدند. دیوسکوردین به عنوان فارماکولوژیست یونانی گیاه شیرین بیان را در بین 650 گیاه دارویی یونانی قرار داد. در آغاز امپراطوری رم در قرن چهار پلینیوس (Plinius) ویژگی بسیار جالب و تعجب برانگیزی را برای شیرین بیان ذکر کرد. به عنوان مثال او پیشنهاد کرد که از شیرین بیان در درمان آسم، گلودرد، عفونت و زخم دهان و حتی جهت استریل کردن، می¬توان استفاده کرد. دانشمندان سوئدی در سال 1707 تا 1778 گیاه شیرین بیان را بر اساس جنس و گونه تقسیم بندی کردند. آنها شیرین بیان را در جنس Glycyrrhiza و در سه گونه مختلف شامل Glycyrrhiza glabra، Glycyrrhiza echinata و Glycyrrhiza hirsuta قرار دادند. ریشه این گیاه حاوی گلیسیریزین، فلاونوئید، آسپاراژین، کولین و....می‌باشد (21). در طب سنتی ایران از ریشه این گیاه به عنوان داروی ضدالتهاب استفاده می‌شود. در سال‌های اخیر اثر عصاره‌های گیاهی و ترکیبات مشتق از آنها بر روند فیبروز مورد مطالعه قرار گرفته و اثرات مثبت آنها گزارش شده است. شیرین بیان خواص متعددی دارد که از آن جمله می‌توان به خواص ضدالتهابی، ضد آسم، ضدسرفه و خواص آنتی اکسیدانی اشاره کرد و با توجه به اثر آن بر التهاب و رادیکال‌های آزاد اکسیژن این احتمال مطرح است که بتواند بر روند فیبروز ریوی نیز موثر باشد (22). ترکیبات شیرین بیان اسید گلیسریزیک (GA)، لکورین (LQ)، گلابریدین (GB) و لکورینگین (LG) می باشند. مطالعات متعددی در سال های اخیر برروی ترکیبات اصلی شیرین بیان و مشتقات آنها و اثرات درمانی صورت گرفته است. اجزای مختلف شیرین بیان خصوصیات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی را دارند. در شرایط کشت سلول و مطالعات انجام شده در شرایط in vitro، ترکیبات LG، LQ و GA موجب مهار سنتز NO شده اند. آنزیم iNOS مسئول سنتز NO می باشدکه ترکیبات مذکور موجب کاهش بیان این آنزیم می شوند. NO بر سنتز سایتوکین های محرک التهاب از قبیل TNF-αو IL-1β و بیان آنها اثر می گذارند. بنابراین ترکیبات LG، LQ و GA با مهار سنتز NO بر سنتز سایتوکین های محرک التهاب و فرآیند التهاب اثر می گذارند (23). از ترکیبات مشتق شده از شیرین بیان می توان به 18-β-گلیسریتینک و اگلیکان (مشتق از گلیسریزین) اشاره کرد. این مشتقات در مدل¬های حیوانی که تحت تیمار بااز قبیل تتراکلرید کربن وt-BHP بوده اند. دارای اثر محافظتی برای سلول¬های کبد بوده¬اند. t-BHP از مسیر سیتوکروم P450 متابولیزه شده و موجب ایجاد رادیکال¬های آزاد و ایجاد شرایط استرس¬های اکسیداتیو و آسیب¬های سلولی می¬شود. 18-β-گلیسریتینک و اگلیکان با مهار رادیکال¬های آزاد موجب مهار آسیب¬های سلولی و در نتیجه حفظ یکپارچگی سلولی می¬شود (21, 23). ترکیبات دی گلیسریزینات و ایزولکورینگین از مشتقات سازنده شیرین بیان به میزان قابل توجهی موجب مهار NO و اینترلوکین-بتا و اینترلوکین-6 می¬شوند. دی گلیسریزینات و ایزو لکورینگین به طور قابل توجهی موجب مهار سنتز سایتوکین¬ها شده ولی گلیسریزین (از مشتقات شیرین بیان) اثر مشابه را ندارد. بنابراین ترکیبات دی گلیسریزینات و ایزولکورینگین موجب کاهش سنتز سایتوکین¬های مهار التهاب می¬شوند ولی این اثرات در ترکیب دیگر شیرین بیان (گلیسریزین) مشاهده نشد (24). ترکیب 18β-گلیسریتینیک اسید و مشتقات آن در رده سلولی RAW 264.7 مربوط به ماکروفاژها خصوصیات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی درا نشان داده اند. مشتقات ترکیب 18β-گلیسریتینیک اسید موجب مهار سنتز TNF- ɑ و در نتیجه کاهش علایم ناشی التهابی از سنتز TNF- a شدند. NO از از ترکیبات مهم در القای خصوصیات سایتوتوکسیتی وابسته به ماکروفاژها می¬باشد که در ایجاد شرایط التهابی حاد و در نتیجه آسیب به بافت مغز و القای بیماری¬های نولوژیک بسیار مهم است. مشتقات 18β-گلیسریتینیک اسید با مهار سنتز NO در رده سلولی RAW 264.7 موجب مهار التهاب و در نتیجه کاهش پیشرفت بیماری¬های ناشی از التهاب می¬شوند (25). عصاره شیرین بیان همچنین موجب کاهش سطح فاکتورهای محرک التهاب TNF-α و اینترلوکین-6 ( IL-6) و افزایش سنتز سایتوکین مهار کننده التهاب اینترلوکین-10 (IL-10) می¬شود. فاکتور رونویسی NF- kB از جمله فاکتورهای کنترل کننده التهاب می-باشد که از طریق کنترل سنتز فاکتورهای دخیل در التهاب شامل سایتوکین های محرک التهاب، COX- 2 و iNOS در فرآیند التهاب نقش دارد. مشاهده شده است که گلیسریتینیک اسید با مهار فسفریلاسیون و در نتیجه جلوگیری از فاکتور Ik-B (مهارکننده NF-kB) موجب مهار التهاب و کاهش علایم ناشی از آن می شود (26, 27). 3-1-4-بررسی متون و مطالعات انجام شده نتایج Ilbey و همکارانش (2009) نشان داد که تزریق تک دز 100 mg/kg body weight داروی سیکلوفسفامید می¬تواند موجب کاهش وزن بیضه، کاهش تعداد و تحرک و مورفولوژی اسپرم،کاهش گلوتاتیون (GSH)، تخریب ضخامت لایه¬های اپیتلیال لوله¬های منی¬ساز (سمینفروس) و فیبروز پری¬واسکولار گردد. آنها همچنین نشان دادند که تجویز داخل صفاقی 10 mg/kg body weight ملاتونین می¬تواند باعث بهبود سطح گلوتاتیون، کاهش مالون دی آلدهید (MDA) و بهبود مورفولوژی اسپرم گردد (28). مطالعه Ceribaşi و همکاران (2009) نشان داد که تجویز خوراکی 15 mg/kg body weight داروی سیکلوفسفامید یک بار در هفته به مدت 8 هفته به موش می تواند موجب افزایش تعداد اسپرم های آسیب دیده و سطح MDA و کاهش معنادار ضخامت لایه سلولهای ژرمینال، قطر لوله های منی ساز و نمره بندی کیفی جانسن نسبت به گروه کنترل شود (29). Tung و همکاران (سال 2015) نشان دادند که دو ترکیب ریشه شیرین بیان شامل isoliquiritigenin و formononetin باعث افزایش تعداد جنین دوسلولی و بلاستوسیست و موفقیت در باروری می¬شود (30). Ling و همکاران (سال 2013) اثر 18β-glycyrrhetinic acid (GA) مشتق از شیرین بیان در مقابل آسیب القا شده توسط LPS بر سلول¬های اپیتلیالی روده بررسی کردند. این محققین دزهای 0.1، 1 و 10 میکرومول بر لیتر را برای 24 ساعت به محیط کشت سلول¬های انکوبه شده با LPS را اضافه کردند. سپس سطح TNF-α و IL-6، سطح نینریک اکساید (NO) و اکسیژن واکنشی (ROS) را ارزیابی کردند. نتایج نشان داد که افزودن GA موجب مهار IL-6 و TNF-α، کاهش سطح NO و ROS می¬شود. همچنین سطح بیان COX-2 کاهش می یابد که نشان از اثر محافظتی این ماده بر سیستم گوارشی از طریق مهار فاکتورهای پیش التهابی می شود (31). Yang و همکاران (2018) اثر عصاره الکلی شیرین بیان (GRR) را در مدل سندرم پلی کیستیک تخمدان (PCOS) بررسی کردند. آنها دز 300 mg/kg عصاره GRR را به مدت 2 هفته به موشها تزریق کردند و سطح LH، FSH، تعداد فولیکولهای کیستی و سطح بیان مارکرهای فاز فولیکولی از قبیل Kitl، Cyp11a1 و Ptgs2 را ارزیابی کردند. نتایج نشان داد که تزریق GRR موجب افزایش سطح FSH، کاهش تعداد فولیکول¬های کیستیک، افزایش تعداد فولیکول¬های آنترال و کاهش ضخامت لایه تکای فولیکولی می¬شود. این محققین پیشنهاد کردند که شیرین بیان باعث بهبود علایم PCOS شده و سطح هورمونی را تنظیم می¬کند (32). Orazizadeh و همکاران (سال 2014) اثر اسید گلیسریزیک (GA) را بر هپاتوتوکسیسیتی ناشی از نانوذره تیتانیوم دی اکسید (NTiO2) در موش بررسی کردند. آنها GA را با دز 100 mg/kg به مدت 7 روز در گروهی که 14 روز NTiO2 دریافت کرده بودند، بصورت گاواژ تجویز کردند. سپس میزان ALT، AST و ALP (به عنوان بیومارکرهای خونی آسیب کبدی)، سطوح SOD و MDA و GPX (به عنوان فاکتورهای استرس اکسیداتیو) و همچنین میزان سلول¬های آپوپتوز شده بررسی شد. نتایج نشان داد که میزان ALT، AST و ALP در گروه دریافت کننده GA بطور معناداری کاهش یافته، سطح آنزیم های SOD و GPX افزایش یافته و همچنین تعداد سلول¬های آپوپتوتیک کاهش یافته است (33). روش اجرا پژوهش حاضر از نوع مطالعه تجربی بود که در آن به بررسی و مقایسه اثر عصاره هیدروالکلی شیرین بیان و اسید گلیسریزیک بر هورمون¬های جنسی، سطح مالون دی¬آلدهید و بافت¬شناسی بیضه در موش‌های نر بالغ نژاد NMRI اکسپوز شده با سیکلوفسفامید پرداخته شد. محیط پژوهش در این مطالعه، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، آزمایشگاه بافت¬شناسی و لانه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد بود. 3-3-1-گروه¬بندی حیوانات و انجام تزریقات جامعه مورد مطالعه در این پژوهش شامل 80 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به وزن تقریبی 30 گرم و سن 8 هفته بود. موش‌ها در اتاقی با شرایط استاندارد نور و دما نگهداری شدند و دسترسی آزاد به آب و غذای مناسب برای آنان فراهم گردید. گروه¬بندی به صورت زیر بود: ۱-کنترل نرمال: فقط دریافت نرمال سالین. ۲-کنترل سیکلوفسفامید: هر موش دریافت یک تک دز ۱۰۰ mg/kg سیکلوفسفامید. ۳-کنترل شیرین بیان: فقط دریافت شیرین بیان با دز ۱۵۰ mg/kg. ۴-کنترل اسید گلیسریزیک: فقط دریافت اسید گلیسریزیک با دز ۰.۵ mg/kg. ۵-گروه مداخله سیکلوفسفامید+شیرین بیان ۱: هر موش دریافت یک تک دز ۱۰۰ mg/kg سیکلوفسفامید و دز ۵۰ mg/kg عصاره شیرین بیان. ۶-گروه مداخله سیکلوفسفامید+ اسید گلیسریزیک: هر موش یک تک دز ۱۰۰ mg/kg سیکلوفسفامید و اسید گلیسریزیک دریافت می کند. ۷-گروه مداخله سیکلوفسفامید+شیرین بیان ۲: هر موش دریافت یک تک دز ۱۰۰ mg/kg سیکلوفسفامید و دز ۱۵۰ mg/kg. عصاره شیرین بیان. ۸-گروه مداخله سیکلوفسفامید+شیرین بیان ۳: هر موش دریافت یک تک دز ۱۰۰ mg/kg سیکلوفسفامید و دز ۲۵۰mg/kg. عصاره شیرین بیان. تزریقات (هم سیکلوفسفامید و هم شیرین بیان و هم اسید گلیسریزیک) بصورت داخل صفاقی بود. تزریق سیکلوفسفامید (Endoxan; Baxter GmbH, Germany) با یک تک دز ۱۰۰ mg/kg وزن بدن صورت گرفت (۲۶). شیرین بیان با دزهای ۵۰، ۱۵۰ و ۲۵۰ mg/kg وزن بدن ۲ ساعت بعد از تزریق سیکلوفسفامید و به مدت ۷ روز متوالی تزریق شد (۴۷) و اسید گلیسریزیک نیز با دز ۰.۵ mg/kg به مدت ۷ روز تزریق شد (۴۸). 3-3-2-روش تهیه عصاره هیدروالکلی شیرین بیان: جهت تهیه عصاره موردنظر از روش خیساندن استفاده شد. پس از تمیز کردن و جداسازی ضایعات، مقدار ۵۰۰ گرم ابتدا آسیاب شد و پس از عبور از غربال داخل ظرف شیشه¬ای ریخته شد و بر روی آن مخلوط آب و الکل به نسبت ۷۰ درصد الکل اتانول و ۳۰ درصد آب مقطر ریخته شد. این مخلوط به مدت ۷۲ ساعت و در دمای ۱۵ تا ۲۰ درجه محیط آزمایشگاه و به دور از نور مستقیم خورشید و لامپ¬های روشنایی خیسانده شد. پس از ۷۲ ساعت، مخلوط خیسانده شده عصاره، آب و الکل، از قیف بوخنر عبور داده شد و با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره ۱، صاف و در بالن جمع-آوری گردید. سپس بر روی مواد باقیمانده از پودر گیاه چند مرحله الکل ریخته شد و مجدداً صاف گردید که در نهایت محلول کم¬رنگی بدست آمد. محلول بدست آمده با استفاده از دستگاه روتاری در دمای آب ۳۸ درجه سانتیگراد و چرخش ۷۵ دور در دقیقه، تغلیظ شد. محلول غلیظ به دست آمده از این مرحله در دستگاه انکوباتور با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت و پس از حدود ۷۲ ساعت عصاره خشک شد و در داخل یخچال با دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد. 3-3-3-سنجش سطح هورمون¬های جنسی: یک روز بعد از آخرین تزریق، حیوانـات بـا کتامین-زایلوزین بیهوش شدند و خونگیری از قلب حیوانات جهت انجام آزمایشات سرمی صورت گرفت. نمونه‌های خون در میکروتیوب جمع‌آوری شد و سپس سطح سرمی مالون دی¬آلدهید، FSH و LH جدا شد. سطح FSH سرم توسط کیت استاندارد الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت. به چاهک‌های کیت الایزا (ZellBio, Germany) ۴۰ لاندا از هر کدام از نمونه‌های سرمی اضافه شد و سپس ۱۰ لاندا از FSH antibody و ۵۰ لاندا از Streptaridrn اضافه شد. بقیه مراحل مطابق دستورالعمل کیت انجام شد. در نهایت محلول Stop به چاهک‌ها اضافه شد و با قرار دادن کیت استاندارد الایزا داخل دستگاه Elisa Reader، میزان جذب نوری خوانده شد. سطح LH سرم نیز توسط کیت استاندارد الایزا (ZellBio. Germany) مورد ارزیابی قرار گرفت. مراحل مطابق دستورالعمل کیت انجام شد و با قرار دادن دادن کیت داخل دستگاه Elisa Reader، میزان جذب نوری خوانده شد. 3-3-4-سنجش سطح مالون دی¬آلدئید (MDA): اساس این روش، واکنش مالون دی¬آلدئید با تیوباربیتوریک اسید در دمای جوش است. در این آزمایش مالون دی¬آلدئید با تیوباربیتوریک اسید واکنش داده و رنگ صورتی ایجاد می¬شود که بیشترین جذب نوری آن در طول موج ۵۳۲ نانومتر است. محلول کار همان اسید استیک است که برای ساخت آن به ازای هر 100 سی سی اسید استیک 20% مقدار نیم گرم تیوباربیتوریک اسید اضافه شد. برای ساخت سدیم دو دسیل سولفات (SDS) مقدار 2 گرم SDS به حجم 25 سی سی رسید. این واکنش در PH=3-4، دمای ۹۰ درجه سانتیگراد و به مدت ۱۵ دقیقه انجام شد. برای اینکار 100 میکرولیتر از نمونه و 100 میکرولیتر SDS در لوله ریخته شد سپس محلول کار به هر لوله اضافه شد و با درپوش آلومینیوم لوله¬ها پوشانده شد و به مدت 1 ساعت در بن¬ماری ۹۰ درجه سانتیگراد قرار داده شد تا واکنش به اتمام رسید. سپس لوله¬ها در آب سرد قرار داده شد و در دور 4۰۰۰ rpm به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد و جذب نوری محلول در طول موج ۵۳۲ نانومتر در مقابل بلانک معرف توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر بررسی گردید. 3-3-5-بررسی¬های بافت¬شناسی: موش‌ها بلافاصله بعد از خونگیری کشته شدند و برای بررسی هیستولوژی بیضه، بافت بیضه با استفاده از روش معمول آزمایشگاهی رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) آماده-سازی شد. این مراحل شامل فیکساسیون در فرمالین ۱۰ درصد، آبگیری، نفوذ‌پذیری پارافین، قالب‌گیری، برش‌گیری با ضخامت ۵ میکرومتر، پارافین‌گیری و رنگ‌آمیزی بود. سپس مقاطع بافتی بطور متوالی (Serial Section) تهیه شد و پس از چسباندن لامل توسط میکروسکوپ نوری مطالعه و ارزیابی گردید. ویژگی¬های کیفی بافتی براساس مورفولوژی خاص لوله سمی¬نیفروس گزارش کردیم. 3-3-6-تجزیه و تحلیل داده¬ها: داده‌های این مطالعه وارد نرم افزار SPSS ورژن ۲۰ شد. با توجه به اینکه داده¬ها توزیع نرمال نداشتند از تست ناپارامتریک کروسکال-والیس برای آنالیز نمونه¬ها استفاده شد و سطح معنی‌دار کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. یافته ها 3-4-1- نتایج بافت شناسی نتایج بررسی هیستوپاتولوژیک بیضه در گروه¬های مختلف، درجات مختلفی از تغییرات دژنراتیو در بافت بیضه را نشان می دهد که میزان آن متغییر است. در گروه 1 (شکل 3-1 تصویر A)، 3 (شکل 3-1 تصویر B)و 4 (شکل 3-1 تصویر C) یکپارچگی مجاری سمی نفروس دیده می‌شود و تمام سلول‌های رده اسپرمی و غشای پایه منظم مجاری سمی نفروس دیده می‌شود که رده‌های اسپرماتوگونیا بر روی آن قرار دارند. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با سیتوپلاسم اسیدوفیل مشاهده می‌شوند. اسپرماتوژنز قابل رویت است. اگرچه آرایش سلولی و ساختار اپیتلیوم در گروه¬های 3 و 4 نسبت به 1 منظم¬تر است (شکل 3-1). در گروه 2 قطر مجاری سمی‌نفروس کاهش یافته است. مجاری سمی‌نفروس نامنظم بوده و غشای پایه چین¬دار است. همچنین اپیتلیوم دچار آتروفی و واکوئلیزاسیون شدید شده است. اسپرماتوژنز در همه مقاطع دیده نمی‌شود. ادم و التهاب بافتی چشمگیری همراه با کاهش تعداد توبول‌های سمی‌نفروس وجود دارد. در اینجا از بین رفتن انسجام بافتی و ایجاد فاصله بین سلول¬ها و اتساعات غیرعادی همراه با سلول‌های لنفوسیت و پلاسماسل دیده می‌شود که نشان دهنده التهاب در بافت بینابینی است (شکل 3-2). در گروه 5 اگرچه همه سلول‌های اسپرمی دیده می‌شوند و سلول‌های لیدیگ در بافت بینابینی نمای طبیعی دارند، اما هنوز کاهش قطر لوله‌ها و کاهش ضخامت لوله¬ها دیده می‌شود. بعلاوه، تغییراتی در بافت بینابینی بصورت بیرنگ شدن سلول-های لیدیگ دیده می شود (شکل 3-3 تصویر A). در گروه 6 مجاری سمی نفروس و تمام سلول‌های رده اسپرمی دیده می‌شوند، اما تعدادشان کمتر است. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با سیتوپلاسم اسیدوفیل مشاهده می‌شوند. اگرچه اسپرماتوژنز قابل رویت است اما همچنان ادم در بافت بینابینی همراه با اثرات جزیی از واکوئلیزاسیون دیده می‌شود (شکل 3-3 تصویر B). در گروه¬های 7 و 8 کمی اسپرماتوژنز دیده می‌شود. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با هسته پیکنوتیک دیده می‌شوند. همچنین سلول‌های با ویژگی تخریبی از جمله کاهش اسیدوفیلی سیتوپلاسم و افزایش رنگ¬پذیری هسته وجود دارد. بعلاوه درهم ریختگی نسبی اپیتلیوم ژرمینال دیده می‌شود (شکل 3-4 تصویر A و B). شکل 1-3. یکپارچگی مجاری سمینفروس همراه با غشای پایه منظم و حضور سلول‌های رده اسپرمی و ظاهر نرمال سلول¬های بینابینی در گروه 1، 3 و 4 است. تصویر A: گروه 1، تصویر B: گروه 3 و تصویر C: گروه 4. رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10 شکل 2-3. وجود تغییرات تخریبی و التهابی بصورت آتروفی بافت بیضه و چین¬دار شدن غشای پایه در گروه دریافت کننده سیکلوفسفامید (گروه 2). رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. شکل 3-3. حضور رده¬های سلولی اسپرم و کاهش التهاب در بافت بینابینی بیانگر بهبود نسبی اسپرماتوژنز است اما همچنان درهم ریختگی اپیتلیوم دیده می¬شود و میزان لوله‌های سمینفروس کاهش دارد. تصویر A: گروه 5 و تصویر B: گروه 6. رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. شکل 4-3. کاهش اثرات التهابی و دژنراتیو در رده¬های اسپرم و غشای پایه دیده می¬شود اما تعداد سلول¬های زایا کم است و بصورت عدم یکدست بودن بافت دیده می شود. سلول‌های بافت بینابینی دارای ویژگی¬های تخریبی هستند و بصورت پیکنوتیک دیده می¬شوند. تصویر A: گروه 7 و تصویر B: گروه 8؛ رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. 3-4-2- نتایج هورمون¬های جنسی سطح LH در گروه 2 در مقایسه با گروه 1 کاهش معناداری داشت (به ترتیب 1.11±0.35 و 3.31±2.45؛ p=0.04). تزریق اسید گلیسریزیک (گروه 6) و دزهای مختلف شیرین بیان (5، 7 و 8) منجر به تغییر معنادار در سطح LH در مقایسه با گروه 2 نشد. در دیگر گروه ها نیز تغییر معناداری در سطح LH مشاهده نشد (p>0.05). سطح FSH در گروه 2 در مقایسه با گروه 1 کاهش معناداری داشت (به ترتیب 4.41±1.75 و 10.22±2.65؛ p=0.002). اگرچه تزریق دز 50 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 5) شیرین بیان باعث افزایش معناداری سطح FSH در مقایسه با گروه 2 شد (p=0.013) اما دزهای 150 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 7) و 250 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 8) اختلاف معناداری با گروه 2 نداشتند (به ترتیب p=0.101 و p=0.471). همچنین سطح FSH در گروه 6 نسبت به گروه 2 افزایش نشان داد (p=0.015). در دیگر گروه ها سطح FSH تغییر معناداری مشاهده نشد (p>0.05) (شکل 5-3). 3-4-3- نتیجه مالون دی¬آلدئید سطح MDA در گروه 2 به گروه 1 افزایش معناداری نشان داد (p=0.013). سطح MDA در گروه 5 نسبت به گروه 2 کاهش معناداری داشت (p=0.038) (شکل 5-3). در دیگر گروه های دریافت کننده عصاره شیرین بیان (گروه¬های 7 و 8) و همچنین گروه دریافت کننده اسید گلیسریزیک (گروه 6) تغییرات MDA معنادار نبود. در دیگر گروه ها نیز تغییر معناداری در سطح MDA مشاهده نشد (p>0.05). شکل 5-3. تغییرات سطح هورمون¬های جنسی و مالون دی¬آلدئید در گروه¬های مطالعه. بحث و نتیجه گیری سیکلوفسفامید یک داروی ضد سرطان است که در بدن به یک متابولیت فعال آلکیله کننده تبدیل می‌گردد و یک جز اساسی و مهم در بسیاری از ترکیبات دارویی موثر می‌باشد. سیکلوفسفامید به راحتی از دستگاه گوارش جذب می‌گردد و از سد خونی-مغزی عبور کرده و به طور گسترده در بافت‌ها و مایعات بدن توزیع می‌گردد و در کبد به متابولیت‌های فعال تبدیل شده و سرانجام از طریق کلیهها دفع می‌گردد (34). مطالعه Elangovan و همکارانش (سال 2006) بر روی دستگاه تولیدمثلی موش مواجهه یافته با سیکلوفسفامید نشان داد موش¬های دریافت کننده سیکلوفسفامید کاهش LH و FSH خون دارند، که در مطالعه حاضر نیز میزان هورمون‌های جنسی موش‌های مواجهه یافته با سیکلوفسفامید کاهش قابل توجهی را نشان می داد (35). شیرین بیان علاوه بر تکریبات پایه اصلی دارای ترکیبات فعال زیستی دیگری مانند: وانیلیک اسید (Vanillic acid)، بنزوئیک اسید (Benzoic acid)، کوئرستین (Quercetin)، رتین (Rutin)، نارینجین (Naringin)، لیکویریتین (Liquiritin)، فرولیک اسید (Ferulic acid)، کوماریک اسید (coumaric acid)، کامپفرول (Kaempferol)، آپیجنین (Apigenin)، ایزولیکویرتیگن (isoliquiritigenin) و فرمونونتین (formononetin) است (36, 37). Akondi و همکاران (سال 2011) اثر محافظتی Rutin و Naringin بر کیفیت اسپرم در رت¬های دیابتی شده با استرپتوزوتوزین (STZ) را بررسی کردند. در این مطالعه بعد از القای دیابت در گروه های مربوطه میزان 10mg/kg ماده Naringin و Rutin بصورت داخل صفاقی به مدت 45 روز تزریق شد و تاثیر آنها بر روی پارامترهای اسپرم و استرس اکسیداتیو رت های دیابتی نوع 1 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در رت های دیابتی تعداد اسپرم، تحرک اسپرم و زیست پذیری، همچنین سطح سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز کاهش یافته و سطح MDA افزایش می یابد. در گروه های دریافت کننده هم رُتین و نارنگین تمام پارامترهای اسپرم بهبود یافته، سطح MDA کاهش معنادار پیدا کرده و سطح SOD و کاتالاز افزایش یافته است (38). Kim and Park گزارش کردند که ایزوفلاونها، از جمله فرمونونتین، در تکامل جنسی مانند زمان¬بندی بلوغ، سیکل گذاری چرخه استروس معیوب، عملکرد تخمدان و عملکردهای هیپوتالاموس و هیپوفیز نقش دارند (39). فلاونوئید کوئرستین به عنوان یک آنتی¬اکسیدان و جاروبگر رادیکال¬های آزاد قلمداد می¬شود که از آنتی¬اکسیدان¬های دیگر از جمله ویتامین C و ویتامین E قویتر است (40). اثرات محافظتی کوئرستین در برابر استرس اکسیداتیو در بافت پانکراس موش¬های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوزین نشان داده شده است بطوری که در گروه دریافت کننده کوئرستین سطح مالون دی آلدئید (MDA) کاهش و فعالیت آنزیم¬های سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون پراکسیداز افزایش می¬یابد (41). رتین طبیعی (3′,4′,5,7-tetrahydroxyflavone-3-rutinoside) یکی از مهمترین عناصر فیتوشیمیایی است که به عنوان فلاونوئیدی زیستی در نظر گرفته می¬شود و برای جذب ویتامین C ضروری است (42). رُتین طیف وسیعی از اکسیدان¬های سلولی از قبیل: hydroxyl radical، superoxide radical و peroxyl radical را مهار می¬کند و همچنین بعنوان شلاته¬کننده یون¬های فلزی که توانایی اکسید کردن پراکسیداسیون لیپید را دارند، عمل می¬کند (43). پودر شیرین بیان حاوی پروتئین، چربی، رطوبت، فیبر، سیلیس، کربوهیدرات، مواد معدنی (مانند کلسیم، فسفر، سدیم، پتاسیم، روی و مس) و آمینواسیدهایی از جمله سرین، آسپارتیک، گلیسین، گلوتامیک، ترئونین، والین، پرولین آلانین، ایزولوسین، تیروزین، لوسین، لیزین، فنیل آلانین، تیروزین و هیستیدین است. همچنین HPLC عصاره متانولی شیرین بیان چندین اسید آلی مانند اسید استیک، پروپانوئیک، فوماریک، سیتریک، بوتیریک، مالیک و تارتاریک را تشخیص داد (44). Calò و همکارانش [22] اثر التهابی اسید گلیسیرتینیک و آلدوسترون را با استفاده از لکوسیت های تک هسته ای مورد بررسی قرار دادند. شیرین بیان با مهار فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2 که برای فرآیندهای التهابی مختلف بسیار مهم است، یک فعالیت ضدالتهابی مشابه هورمون استروئیدی (هیدروکورتیزون) را نشان می¬دهد (45). شیرین بیان و ترکیبات آن از طریق جلوگیری از ROS توسط نوتروفیل¬ها در محل التهاب دارای فعالیت¬های هپاتوپروتکتیو و آنتی¬اکسیدانی است. گزارش شده است که هیسپاگلابریدین A و B (Hispaglabridin A,B) و ایزوفلاون¬های شیرین بیان از پراکسیداسیون میتوکندریایی لیپید در سلول¬های کبدی موش جلوگیری می¬کنند. مواد فیتوشیمیایی جدا شده از شیرین بیان همچنین دارای اثر محافظتی کبدی از طریق کاهش سطح آنزیم¬های اکسیداتیو کبدی در بیماران مبتلا به هپاتیت است (46). ترکیب لیکوکومارون در شیرین بیان، از طریق فسفوریلاسیون BCl2 و توقف فاز G2/M چرخه سلولی باعث القاء آپوپتوز سلول¬های لوسمی مونوبلاستیک در انسان می¬شود (47). مطالعات نشان می دهد که دزهای پایین عصاره ریشه شیرین بیان دارای فعالیت های ضد دیابت و کاهنده چربی در موش است (48). این گزارشات با نتایج ما همخوانی دارد که دز پایین عصاره نسبت به دزهای بالا اثر بیشتری بر بهبود سطح LH، FSH و MDA دارد. همچنین Mendes-Silva و همکاران گزارش کردند که تجویز گلیسیریزین بر سطح سرمی آنزیم¬های آنتی اکسیدانی فروکتوزامین، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و مالون دی آلدئید در موشهای دیابتی اثر تعدیلی داشته و آنها را به محدوده نرمال خود بازگرداند (49). مطالعات قبلی نشان داده بود که شیرین بیان باعث مهار فعالیت 3β-هیدروکسی استروئید دهیدروژناز (3HSD) و 17-هیدروکسی استروئید دهیدروژناز (17HSD) و تحریک فعالیت آروماتاز می شود که در متابولیسم آندروژن ها و استروژن ها نقش دارد. همچنین Glycyrrhiza به عنوان مهار کننده 11-بتا هیدروکسی استروئید دهیدروژناز (11-HSD2) عمل می کند که متعاقباً ترشح کورتیزول را فعال می کند و منجر به افزایش اثر مینرالوکورتیکوئیدها می شود. اثر مهاری گلیسیرتینیک اسید بر روی 11-HSD2 حتی در غلظت¬های پایین سرم رخ می¬دهد (14 و 15). Shamsi و همکاران نشان دادند که دزهای 100 و 150 میلیگرم باعث افزایش سطح تستوسترون و استرادیول و کاهش کیست های تخمدانی و بهبود باروری داخل-آزمایشگاهی (IVF) در موش¬های pcos می شود (50). مطالعات نشان می¬دهد که شیرین بیان باعث افزایش بهبود شاخص¬های هیستومورفولوژیک و هیستوپاتولوژیک و کاهش معنادار سطح MDA همراه با افزایش سطح کاتالاز (CAT) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در رت¬های دریافت کننده ماده سمی کاربندازیم (Carbendazim) می¬شود که در مطالعه حاضر نیز تعدیل سطح MDA و بهبود ویژگی¬های هیستولوژیک در موش¬های دریافت کننده شیرین بیان مشاهده شد (51). Isoliquiritigenin که یک فیتواستروژن فلاونوئیدی در ریشه شیرین بیان است، به عنوان یک عامل ضد التهابی، ضدمیکروبی، ضد دیابت و ضدسرفه استفاده می¬شود (52). isoliquiritigenin از رشد و فعالیت آروماتاز سلول¬های سرطانی سینه جلوگیری می¬کند و بنابراین می¬تواند به عنوان یک عامل شیمی درمانی در سرطان سینه مورد استفاده قرار گیرد (53, 54). مطالعه Chen و همکاران (2019) نشان داد که دو ماده liquiritin (LQ) و liquiritigenin (LG) که در عصاره شیرین بیان نیز وجود دارند، باعث بهبود آسیب اندوتلیال سینوزوئیدهای کبد و کاهش میزان گسترش نوتروفیل¬ها، فعالیت میلوپراکسیداز، بیان IL-6 کبدی و فعال سازی NFκB می¬شوند که در اثر تزریق سیکلوفسفامید دچار تغییر شده بودند (55). همچنین Huang و همکاران (2018) نشان دادند که LQ و LG باعث کاهش شاخص های MMP-9، ROS و MDA و افزایش GSH و SOD و همچنین افزایش بیان فاکتور هسته¬ای مرتبط با اریتروئید-2 (Nrf2) (یک فاکتور رونویسی مهم دخیل در تنظیم آنزیم-های آنتی¬اکسیدانی پایین¬دست) می¬شوند که توسط مونوکروتالین (monocrotaline) دچار اختلال شده بودند (56). در مطالعه ما نیز نشان داده شد که عصاره شیرین بیان باعث کاهش MDA افزایش یافته در نتیجه سیکلوفسفامید می¬شود که در دز پایین عصاره کاهش این شاخص استرس اکسیداتیو معنادار است. از آنجایی که MDA یک بیومارکر شناخته شده برای نشان دادن عدم تعادل احیاء-اکسیداسیون (oxidation-reduction) است (57)، بنابراین افزایش این مارکر بعد از تزریق سیکلوفسفامید احتمالاً منجر به تغییرات التهابی و اختلال در چرخه اسپرماتوژنز می¬شود که در ارزیابی هیستولوژیک مطالعه ما نیز مشاهده شد. این نتایج نشان می¬دهد که شیرین بیان بخصوص در دز پایین دارای اثرات آنتی اکسیدانی قوی و خاصیت ضدالتهابی مناسبی بوده و از بافت بیضه در مقابل اثرات مخرب داروهای شیمی درمانی محافظت می¬کند.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها 3-4-1- نتایج بافت شناسی نتایج بررسی هیستوپاتولوژیک بیضه در گروه¬های مختلف، درجات مختلفی از تغییرات دژنراتیو در بافت بیضه را نشان می دهد که میزان آن متغییر است. در گروه 1 (شکل 3-1 تصویر A)، 3 (شکل 3-1 تصویر B)و 4 (شکل 3-1 تصویر C) یکپارچگی مجاری سمی نفروس دیده می‌شود و تمام سلول‌های رده اسپرمی و غشای پایه منظم مجاری سمی نفروس دیده می‌شود که رده‌های اسپرماتوگونیا بر روی آن قرار دارند. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با سیتوپلاسم اسیدوفیل مشاهده می‌شوند. اسپرماتوژنز قابل رویت است. اگرچه آرایش سلولی و ساختار اپیتلیوم در گروه¬های 3 و 4 نسبت به 1 منظم¬تر است (شکل 3-1). در گروه 2 قطر مجاری سمی‌نفروس کاهش یافته است. مجاری سمی‌نفروس نامنظم بوده و غشای پایه چین¬دار است. همچنین اپیتلیوم دچار آتروفی و واکوئلیزاسیون شدید شده است. اسپرماتوژنز در همه مقاطع دیده نمی‌شود. ادم و التهاب بافتی چشمگیری همراه با کاهش تعداد توبول‌های سمی‌نفروس وجود دارد. در اینجا از بین رفتن انسجام بافتی و ایجاد فاصله بین سلول¬ها و اتساعات غیرعادی همراه با سلول‌های لنفوسیت و پلاسماسل دیده می‌شود که نشان دهنده التهاب در بافت بینابینی است (شکل 3-2). در گروه 5 اگرچه همه سلول‌های اسپرمی دیده می‌شوند و سلول‌های لیدیگ در بافت بینابینی نمای طبیعی دارند، اما هنوز کاهش قطر لوله‌ها و کاهش ضخامت لوله¬ها دیده می‌شود. بعلاوه، تغییراتی در بافت بینابینی بصورت بیرنگ شدن سلول-های لیدیگ دیده می شود (شکل 3-3 تصویر A). در گروه 6 مجاری سمی نفروس و تمام سلول‌های رده اسپرمی دیده می‌شوند، اما تعدادشان کمتر است. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با سیتوپلاسم اسیدوفیل مشاهده می‌شوند. اگرچه اسپرماتوژنز قابل رویت است اما همچنان ادم در بافت بینابینی همراه با اثرات جزیی از واکوئلیزاسیون دیده می‌شود (شکل 3-3 تصویر B). در گروه¬های 7 و 8 کمی اسپرماتوژنز دیده می‌شود. در بافت بینابینی سلول‌های لیدیگ با هسته پیکنوتیک دیده می‌شوند. همچنین سلول‌های با ویژگی تخریبی از جمله کاهش اسیدوفیلی سیتوپلاسم و افزایش رنگ¬پذیری هسته وجود دارد. بعلاوه درهم ریختگی نسبی اپیتلیوم ژرمینال دیده می‌شود (شکل 3-4 تصویر A و B). شکل 1-3. یکپارچگی مجاری سمینفروس همراه با غشای پایه منظم و حضور سلول‌های رده اسپرمی و ظاهر نرمال سلول¬های بینابینی در گروه 1، 3 و 4 است. تصویر A: گروه 1، تصویر B: گروه 3 و تصویر C: گروه 4. رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10 شکل 2-3. وجود تغییرات تخریبی و التهابی بصورت آتروفی بافت بیضه و چین¬دار شدن غشای پایه در گروه دریافت کننده سیکلوفسفامید (گروه 2). رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. شکل 3-3. حضور رده¬های سلولی اسپرم و کاهش التهاب در بافت بینابینی بیانگر بهبود نسبی اسپرماتوژنز است اما همچنان درهم ریختگی اپیتلیوم دیده می¬شود و میزان لوله‌های سمینفروس کاهش دارد. تصویر A: گروه 5 و تصویر B: گروه 6. رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. شکل 4-3. کاهش اثرات التهابی و دژنراتیو در رده¬های اسپرم و غشای پایه دیده می¬شود اما تعداد سلول¬های زایا کم است و بصورت عدم یکدست بودن بافت دیده می شود. سلول‌های بافت بینابینی دارای ویژگی¬های تخریبی هستند و بصورت پیکنوتیک دیده می¬شوند. تصویر A: گروه 7 و تصویر B: گروه 8؛ رنگ¬آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) با بزرگنمایی ×10. 3-4-2- نتایج هورمون¬های جنسی سطح LH در گروه 2 در مقایسه با گروه 1 کاهش معناداری داشت (به ترتیب 1.11±0.35 و 3.31±2.45؛ p=0.04). تزریق اسید گلیسریزیک (گروه 6) و دزهای مختلف شیرین بیان (5، 7 و 8) منجر به تغییر معنادار در سطح LH در مقایسه با گروه 2 نشد. در دیگر گروه ها نیز تغییر معناداری در سطح LH مشاهده نشد (p>0.05). سطح FSH در گروه 2 در مقایسه با گروه 1 کاهش معناداری داشت (به ترتیب 4.41±1.75 و 10.22±2.65؛ p=0.002). اگرچه تزریق دز 50 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 5) شیرین بیان باعث افزایش معناداری سطح FSH در مقایسه با گروه 2 شد (p=0.013) اما دزهای 150 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 7) و 250 میلی¬گرم/کیلوگرم (گروه 8) اختلاف معناداری با گروه 2 نداشتند (به ترتیب p=0.101 و p=0.471). همچنین سطح FSH در گروه 6 نسبت به گروه 2 افزایش نشان داد (p=0.015). در دیگر گروه ها سطح FSH تغییر معناداری مشاهده نشد (p>0.05) (شکل 5-3). 3-4-3- نتیجه مالون دی¬آلدئید سطح MDA در گروه 2 به گروه 1 افزایش معناداری نشان داد (p=0.013). سطح MDA در گروه 5 نسبت به گروه 2 کاهش معناداری داشت (p=0.038) (شکل 5-3). در دیگر گروه های دریافت کننده عصاره شیرین بیان (گروه¬های 7 و 8) و همچنین گروه دریافت کننده اسید گلیسریزیک (گروه 6) تغییرات MDA معنادار نبود. در دیگر گروه ها نیز تغییر معناداری در سطح MDA مشاهده نشد (p>0.05). شکل 5-3. تغییرات سطح هورمون¬های جنسی و مالون دی¬آلدئید در گروه¬های مطالعه.

فایل های پژوهش