پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله یکی از‌ روش‌های درمانی سرطان نقش مهمی در کنترل لوکال و ناحیه‌ای بدخیمی‌ها ایفاء می‌کند، رادیوتراپی می¬باشد. مطالعات بسیار زیادی برای افزایش بازده این روش درمانی انجام‌گرفته است، به‌طوری‌که تعداد بسیاری مواد و عوامل به‌عنوان تعدیل‌کننده واکنش‌های سیستم‌های بیولوژی به اشعه مطرح‌شده که قادر به کاهش یا افزایش اثرات دز معینی از اشعه شوند. این تعدیل کنند¬ها به دو صورت محافظت‌کننده‌ها (سلول‌های نرمال را در برابر اشعه حفاظت می‌کنند بدون اینکه اثری بر سلول‌های سرطانی داشته باشند) و یا حساس کننده‌ها (به‌صورت انتخابی اثرات اشعه را بر روی سلول‌های سرطانی افزایش داده بدون اینکه اثری بر سلول‌های نرمال داشته باشند) عمل می‌کنند. یک گروه از حساس کننده که به همراه رادیوتراپی استفاده می‌شود، مواد شیمی‌درمانی می¬باشند که باعث افزایش حساسیت سلول‌های سرطانی شده و اثرات کشندگی اشعه را افزایش می‌دهند. از طرفی استفاده در کاربرد مواد شیمی درمانی محدودیت هایی از قبیل افزایش سمیت، صدمه به بافت نرمال و عوارض جانبی، وجود دارند (1)؛ برای غلبه بر این محدودیت¬ها، مطالعات بسیاری بر روی این حساس کننده‌ها انجام‌گرفته است تا بتوان موادی که سمیت کمی دارند و یا غیر سمی هستند و به‌طور اختصاصی حساسیت سلول‌های سرطانی را بیش از سلول‌های نرمال افزایش می‌دهند‌ را شناسایی کرده و برای کاربرد عملی در رادیوتراپی معرفی نمود. در سال‌های اخیر، مطالعاتی بروی روش¬های درمان ترکیبی انجام پذیرفته که با توجه به افزایش حساسیت‌های سلول‌های سرطانی به رادیوتراپی، منجر به بازده بیشتر درمان می‌شود و از اینرو این نوع روش¬های درمانی مورد توجه قرار گرفته‌اند. یک گروه از حساس کننده پرتویی، داروهای ضد سرطانی می¬باشند که علاوه بر خاصیت حساس¬کنندگی پرتویی، اثر ضد سرطانی هم از خود نشان می‌دهند (2). این داروهای ضد سرطانی در درمان‌های ترکیبی، باعث حساس شدن سلول‌های سرطانی در دزهای کمتر پرتو شده و منجر به کاهش عوارض جانبی رادیوتراپی می‌شوند (3). برومیلین (Bromelain) عصاره آبی آناناس، شامل دو بخش پروتئاز تیول (بخش عمده برومیلین را تشکیل می‌دهد و شامل ریشه (80%)، میوه (10%) و پیاز (5%) است) و بدون پروتئاز (شامل فسفاتاز، گلوکوسیداز، پرواکسیداز، سلولاز، گلیوپروتئین و کربوهیدرات است) است (4, 5). برومیلین در روده انسان به‌راحتی جذب می‌شود و بصورت خوراکی در دزهای بالای 3 گرم در روز در درمان‌های طولانی‌مدت، قابل‌تحمل است (6-9). بر اساس مطالعات سلولی، حیوانی و کلینیکی، برومیلین به‌صورت ضدسرطان عمل می‌کند که مکانیسم آن غالباً مرتبط با ترکیبات پروتئاز آن است (5). برومیلین دارای خواص نظیر سرکوب سلول‌های سرطانی، التهاب، سیستم ایمنی و سیستم هموستاتیک است و ازآنجایی‌که عفونت مزمن، حذف سیستم ایمنی و عدم توازن سیستم هموستاتیک در سرطان‌زایی بسیار مؤثرند، برومیلین می‌تواند بر مسیرهای درگیر در شروع، رشد و پیشروی سرطان، اثر بگذارد. برومیلین در موش‌ها با پاپیلومای پوستی؛ که به‌صورت شیمیایی ایجاد‌شده، باعث کاهش سرطان‌زایی و حجم سرطان و مرگ آپوپتوزی سلول‌ها می‌شود. افزایش بیان ژن‌های فعال‌کننده آپوپتوز (p53 و Bax) و کاهش ژن‌های فعال‌کننده‌ بقای سلول (Akt و Erk) و درنتیجه افزایش مرگ آپوپتوزی سلول‌ها، مکانیسم اثر آن می¬باشد (10) و همچنین در کاهش متاستاز، رشد لوکال سرطان و افزایش آهنگ بقا تأثیر دارد (11, 12). اثر ضد سرطانی برومیلین به‌صورت اثر مستقیم بر سلول‌های سرطانی و اثر غیر‌مستقیم از طریق فاکتورهای سیستماتیک است. در شرایط in vitro، در سلول‌های سرطانی نوع حیوانی، برومیلین مانع رشد تومور و تهاجمی شدن آن می‌شود (13, 14). برومیلین از طریق فعال کردن نوتروفیل‌ها باعث تحریک سیستم ایمنی ذاتی شده و منجر به تولید قطعات اکسیژن (ROS) می‌شود. افزایش ایجاد قطعات اکسیژن (ROS) از طریق نوتروفیل‌ها در شرایط in vitro و هم‌چنین در داوطلبین مشاهده‌شده است (15, 16). افزایش قطعات اکسیژن (ROS) منجر به آسیب‌های DNA می‌شود که در بیماران سرطانی، باعث کنترل سرطان می‌شود (17, 18). با توجه به قابلیت‌های برومیلین و تعداد مطالعات کم به‌‌ویژه در سلول‌های سرطانی نوع انسانی، هنوز مطالعات بیشتری لازم است تا قابلیت‌های این ترکیب را بررسی نمود. ازآنجایی‌که برومیلین بعنوان ترکیب غیر سمی دارای خواص زیادی می¬باشد و به‌صورت تجاری قابل‌دسترس است و تهیه آن، مقرون‌به‌صرفه است، کاربرد آن همراه با روش-های درمانی دیگر و یا به‌صورت درمان تکمیلی می‌تواند بررسی گردد. هدف از این مطالعه بررسی درمان ترکیبی داروی ضد سرطان برومیلین و رادیوتراپی در سلول‌های سرطان پروستات (PC3) در شرایط آزمایشگاهی است. روش اجرا سلول‌ها: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) از بانک سلولی انستیتو پاستور خریداری شدند. سلول‌های سرطانی پروستات انسانی (PC3) ، در محیط کشت RPMI با L-glutamine، 10% FBS و ا% پنی سلین-استرانسیوم، تحت شرایط کشت استاندارد (37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 95% و 5% CO2) کشت داده شدند. مطالعه فوق یک مطالعه بنیادی کاربردی است که هدف از انجام آن، بررسی درمان ترکیبی داروی ضد سرطان برومیلین و رادیوتراپی در سلول‌های سرطانی پروستات انسانی (PC3) در شرایط آزمایشگاهی بود. پرتودهی توسط دستگاه شتاب‌دهنده زیمنس 6 مگاولت در بخش رادیوتراپی کلینیک پارسیان شهرکرد صورت گرفت. پرتو ایکس با دز 6-2 گری و آهنگ دز Gy/min2 به سلول‌های توموری تابیده شد. آماده‌سازی برومیلین: برومیلین از شرکت سیگما-آلدریخ خریداری و در محیط کشت حل شد تا غلظت mg/mL 1 به دست آمد و در دمای C4 نگهداری شد. سپس در حین آزمایش، با افزودن محیط کشت، غلظت‌های نهائی 5، 10، 20، 40، 50، 75، 100، 200، 300، 400 و 600 میکروگرم بر میلی‌لیتر به دست آمد. سلول‌های توموری هرکدام به 4 گروه اصلی تقسیم‌بندی شدند: 1-گروه اول: سلول‌های‌ سرطانی انسانی پروستات (PC3) با غلظت‌های متفاوت برومیلین 5، 10، 20، 40، 50، 75، 100، 200، 300، 400 و 600 میکروگرم بر میلی‌لیتر به مدت 2، 24، 48 و 72 ساعت درمان شدند. 2-گروه دوم: سلول‌های‌ سرطانی انسانی پروستات (PC3) با پرتو ایکس در دزهای 2، 4، 6 و 8 گری (56, 57) تحت تابش‌دهی قرار گرفتند. 3-گروه سوم: سلول‌های‌ سرطانی انسانی پروستات (PC3) به مدت 2، 24، 48 و 72 ساعت با برومیلین درمان شدند و سپس تحت تابش‌دهی قرار گرفتند. 4-گروه چهارم: سلول‌های‌ سرطانی انسانی پروستات (PC3) تمام استرس‌های انتقال به محل تابش و درمان با برومیلین را دریافت کردند ولی هیچ‌گونه درمانی شامل برومیلین و پرتودهی را دریافت‌ نکردند. روش‌های مطالعه: در این مطالعه از آزمون¬های اصلی زیر استفاده شد: 1-آزمون MTT برای بررسی تأثیر برومیلین بر روی بقای سلولی 2-آزمون کلوژنیک (Colony Assay) به‌منظور بررسی میزان حساسیت سلول‌ها به برومیلین، پرتو و ترکیب هم‌زمان برومیلین و پرتو آزمون MTT: به‌منظور بررسی میزان تأثیر برومیلین بر بقای سلول از آزمون استاندارد MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-terazolium-bromide](BIO-IDEA) استفاده شد. در این قسمت از مطالعه گروه‌های درمانی به ترتیب زیر بودند: 1-گروه اول: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) به‌عنوان کنترل مثبت با غلظت‌های متفاوت برومیلین 5، 10، 20، 40، 50، 75، 100، 200، 300، 400 و 600 میکروگرم بر میلی‌لیتر به مدت 2، 24، 48 و 72 ساعت درمان شدند. 2- گروه دوم: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) تمام استرس‌های درمان با برومیلین را دریافت کردند ولی هیچ‌گونه درمانی شامل برومیلین را دریافت نکردند. به‌این‌ترتیب که در هر چاهک از پلیت 96 خانه‌ای، تعداد تقریباً 103×5 سلول را در محیط کشت RPMI حاوی ده درصد FBS منتقل کرده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلول‌ها را با محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف برومیلین تعویض کرده به مدت 2، 24، 48 و 72 ساعت در انکوباتور قرار داده‌ شدند. محیط کشت حاوی برومیلین را از هر خانه پلیت حذف کرده و سلول‌های هر خانه با PBS شستشو داده شدند. در مرحله بعد،l µ 100 محلول MTT(lµ 90 PBS و lµ 10 استوک MTT با غلظت mg/ml 5) به هر خانه از پلیت اضافه شد و پلیت به مدت 4 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. بعدازاین مدت‌زمان، محلول MTT حذف شد و به هر چاهک پلیتl µ 100 دی متیل سولفواکسید، اضافه شد و به مدت 20 دقیقه انکوبه شد، سپس جذب نوری با استفاده از دستگاه الایزا (stat Fax-2100, Spain) با طول‌موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد. این آزمون برای غلظت‌های مختلف برومیلین 3 بار به‌صورت سه‌تایی انجام گرفت. با استفاده از فرمول درصد جذب نوری (جذب نوری گروه کنترل / جذب نوری گروه درمان شده = درصد جذب نوری) میزان بقاء سلول‌ها و درصد زیست پذیری (IC50) سلول‌های تحت درمان در مقایسه با سلول‌های درمان‌نشده محاسبه و بررسی شد (58, 59). آزمون کلوژنیک: اثرات برومیلین بر روی حساسیت پرتویی سلول‌های سرطانی پروستات انسانی (PC3) را نشان‌ داد. در این قسمت از مطالعه گروه‌های درمانی به ترتیب زیر بودند: 1- گروه اول: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) با غلظت IC50 و غلظت‌های 20 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر بیشتر و کمتر از غلظت IC50 برومیلین در زمان انکوباسیون 24 ساعت درمان شدند. 2- گروه دوم: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) با پرتو ایکس در دزهای 2، 4، 6 و 8 گری (56, 57) تحت تابش‌دهی قرار گرفتند. 3- گروه سوم: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) با غلظت IC50 و غلظت‌های 20 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر بیشتر و کمتر از غلظت IC50 برومیلین در زمان انکوباسیون 24 ساعت درمان شدند و سپس تحت تابش‌دهی در دزهای 2، 4، 6 و 8 گری قرار گرفتند. 4- گروه چهارم: سلول‌های‌ سرطانی پروستات انسانی (PC3) تمام استرس‌های انتقال به محل تابش و درمان با برومیلین را دریافت کردند ولی هیچ‌گونه درمانی شامل برومیلین و پرتودهی را دریافت نکردند. به‌این‌ترتیب که در هر چاهک از پلیت 6 خانه‌ای، تعداد تقریباً 1000 سلول را در محیط کشت RPMI حاوی ده درصد FBS برای هرکدام از گروه‌های درمانی منتقل کرده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند. بعد از انجام درمان بر اساس گروه‌های از پیش تعیین‌شده، برای هر پلیت، محیط کشت حذف و با PBS شستشو داده و محیط جدید اضافه شد. سپس پلیت‌ها در انکوباتور برای 8 روز نگهداری شدند و در این مدت 1 روز در میان پلیت‌های حاوی سلول تعویض محیط شدند بعد از 8 روز، محیط کشت از پلیت‌های موردمطالعه حذف و با PBS شستشو داده شد. سپس محلول حاوی %20 اتانول، %7/3 فرمالدین و %2/0 کریستال violet به سلول‌های مربوطه اضافه شد و برای یک‌شب در دمای اتاق نگهداری شد. روز بعد، کلونی‌ها شمارش شدند، گروه‌های 25-20 تایی سلول به‌عنوان کلونی در نظر گرفته شد. بازده کشت سلول‌ها از طریق فرمول (100 * تعداد سلول‌های کشت داده‌شده/تعداد کلونی‌های تشکیل‌شده=بازده کشت) اندازه‌گیری شد. نسبت بقا برای گروه‌های درمانی از طریق فرمول (100 * بازده کشت سلول‌های بدون درمان/ بازده کشت سلول‌های درمانی = نسبت بقاء) محاسبه شد. داده‌های فوق توسط نرم‌افزار Excel به‌صورت نسبت بقاء به‌صورت تابعی از غلظت دارو و یا دزهای متفاوت پرتو رسم شدند. آزمون فلوسایتومتری: آپوپتوز ناشی از درمان ترکیبی برومیلین و پرتودهی ایکس بوسیله کیت Annexin-PI بررسی شد. ابتدا 1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی معادل 105× 5 سلول در میلی لیتر در پلیتهای 6 خانهای ریخته و مقدار 2 میلی لیتر محیط کشت کامل به همراه FBS %10 به چاهکها اضافه گردید. در ادامه غلظت انتخابی برومیلین به چاهکها اضافه می شود و به مدت24 ساعت در انکوبه می شوند. پس از پایان انکوباسیون ، سلولها با دوزهای متفاوت پرتوهای ایکس (2، 4و 6 گری) پرتودهی شدند. سپس کف پلیتهای 6 خانه را با PBS 2 میلی¬لیتر شستشو داده و سپس 2000 rpm/min سانتریفیوژ می شوند. مایع روی نمونه ها دور ریخته شد و سپس به مقدار 10 میکرولیتر Annexin اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه در تاریکی و روی یخ انکوبه شد. پس از گذشت این زمان مقدار 1 میلی¬لیتر PBS به نمونه ها اضافه و به سرعت نمونه ها به وسیله دستگاه فلوسایتومتری ارزیابی شدند. این آزمون سه بار تکرار خواهد شد و داده های بدست آمده توسط نرم افزار Excel بصورت درصد آپوپتوز و تابعی از غلظت برومیلین و دوزهای متفاوت پرتو رسم شدند. کلیه آزمایش‌ها حداقل سه بار و در روزهای مختلف تکرار شدند و به‌منظور مقایسه گروه‌های آزمایشی با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS V.20 در گروه‌های آزمایشی مختلف مقایسه آماری انجام‌ شد. برای مقایسه نتایج گروه‌های موردمطالعه از آزمون‌های نان-پارامتریک کروسکال-والیس (Kruskal-Wallis) و آزمون تکمیلی داون (Dunn) استفاده گردید و شاخص آماری شامل میانگین داده‌ها و انحراف معیارهای آن‌ها به‌صورت Mean ± SD گزارش شد و نمودارها برای متغیرهای مختلف ترسیم و جداول نتایج گزارش گردید. یافته ها در نمودارهای 4-1 تا 4-4 نتایج به¬صورت درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های (g/mlµ) متفاوت برومیلین و در زمان‌های متفاوت انکوباسیون (2، 24، 48 و 72 ساعت) آمده است. در زمان انکوباسیون 2 ساعت (نمودار 4-1)، بین غلظت‌های مختلف به‌کاربرده شده از برومیلین و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود ندارد (05/0P>). در زمان‌ انکوباسیون 24 ساعت (نمودار4-2)، بین غلظت‌های کم برومیلین (g/mlµ 5-40) و بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود نداشت (05/0P>) ولی در غلظت‌های بالای برومیلین (g/mlµ 50-600)، بقای سلول‌های PC3 به¬طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0P<). در زمان¬های انکوباسیون 48 و 72 ساعت (به ترتیب نمودار 4-3 و 4-4)، بین غلظت‌های کم برومیلین (g/mlµ 5-20) و بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود نداشت (05/0P>) لی در غلظت‌های بالای برومیلین (g/mlµ 40-600)، بقای سلول‌های PC3 به¬طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0P<). در نمودارهای 4-5 تا 4-10 نتایج به¬صورت مقایسه بین درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های (g/mlµ) متفاوت برومیلین به ترتیب در زمان‌های متفاوت انکوباسیون (2 و 24، 2 و 48، 2 و 72، 24 و 48، 24 و 72، 48 و 72 ساعت) آمده است. در غلظت‌های پایین و بالا (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 24 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-5). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 48 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (05/0P<) (نمودار 4-6). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-7). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 24 و 48 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (05/0P<) (نمودار 4-8). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 24 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-9). در غلظت‌های متفاوت برومیلین، بین زمان‌های انکوباسیون 48 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P>) (نمودار 4-10). در جدول 4-1 میزان درصد زیست پذیری (IC50) برومیلین بر روی سلول‌هایPC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت آمده است. میزان درصد زیست پذیری برومیلین بر روی سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب 1902، 147، 153 و g/mlµ 91 به دست آمد. نتایج مقایسه درصد زیست پذیری برومیلین بر روی سلول‌های PC3 نشان داد که بین میزان درصد زیست پذیری در زمان انکوباسیون 2 ساعت و میزان درصد زیست پذیری در زمان 24، 48 و 72 ساعت تفاوت معنی‌داری وجود دارد (05/0P<). بین میزان درصد زیست پذیری در زمان‌های انکوباسیون 24، 48 و 72 ساعت تفاوت معنی‌داری وجود ندارد (05/0P>) (جدول 4-2). نمودار 4-1. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 2 ساعت نمودار 4-2. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 24 ساعت نمودار 4-3. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 48 ساعت نمودار 4-4. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 72 ساعت نمودار 4-5. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 24 ساعت نمودار 4-6. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 48 ساعت نمودار 4-7. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 72 ساعت نمودار 4-8. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 24 و 48 ساعت نمودار 4-9. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 24 و 72 ساعت نمودار 4-10. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 48 و 72 ساعت جدول 4-1. میزان IC50 برحسب میکروگرم بر میلی‌لیتر در سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت 72 ساعت 48 ساعت 24 ساعت 2 ساعت سلول زمان 91 153 147 1902 PC3 جدول 4-2. میزان P value در مقایسه بین میزان IC50 در سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت 72 ساعت 48 ساعت 24 ساعت 2 ساعت زمان P<05/0 P<05/0 P<05/0 2 ساعت P>05/0 P>05/0 P<05/0 24 ساعت P>05/0 P>05/0 P<05/0 48 ساعت در نمودار 4-11 نسبت بقای سلول‌های PC3درمان شده با پرتو در مقایسه با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر، آمده است. نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو در دزهای 2، 4 و 6 گری، اختلاف معنی‌داری دارد (05/0P<). نمودار 4-11. نسبت بقای سلول‌های PC3درمان شده با پرتو در مقایسه با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین در نمودارهای 4-12 آپوپتوز القاء شده در سلول‌های PC3درمان شده با پرتو، برومیلین و ترکیب درمان برومیلین و پرتو در مقایسه با سلول‌های کنترل نمایش شده است. آپوپتوز القاء شده در سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر با آپوپتوز القاء شده سلول‌های درمان شده با پرتو در دزهای 2 ،4 و 6 گری، اختلاف معنی‌داری دارد (05/0P<). 12-4. مقدار آپوپتوز سلول‌های PC3درمان شده با برومیلین تنها و پرتو تنها در مقایسه با مقدار آپوپتوز سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر بحث و نتیجه گیری یکی از روش¬های کارآمد و موثر در درمان انواع سرطان¬ها، رادیوتراپی می¬باشد اما این روش درمانی با محدودیت¬های زیادی همراه است. یکی از مهم¬ترین محدودیت¬های رادیوتراپی در درمان سرطان، وجود مقاومت سلول¬ها به پرتو است. این سلول¬ها با تغییر و خودفعالی مسیرهای سلولی در برابر تابش دزهای درمانی پرتو مقاومت نشان داده و دچار مرگ سلولی ن، شده، از اینرو این سلول¬ها بعد از پایان درمان باقی مانده و منجر به بازگشت مجدد سرطان می¬شود. استفاده از ترکیباتی که همزمان با رادیوتراپی، مرگ و میرهای سلول¬های سرطانی را افزایش دهند و همچنین سلول¬های مقاوم به پرتو را مجددا حساس نمایند، یکی از رویکردهای موثر در کاهش این محدودیت¬ها می¬باشد. از لحاظ علم پرتویی، دو نوع مرگ برای سلول تعریف می¬شود: مرگ تولیدمثلی و مرگ عملکردی. مرگ تولیدمثلی که بصورت از دست دادن توانایی تولیدمثل سلول¬های بنیادین سیستم خونساز یا پوشش روده¬ای تعریف می¬گردد و مرگ عملکردی که برای سلول¬های متمایز عصبی یا عضلانی یا بسیاری از سلول¬های ترشحی که تکثیر نمی¬شوند بصورت از دست دادن عملکرد اختصاصی تعریف می¬گردند. مرگ در علم رادیوبیولوژی دارای تعریف متفاوتی است که اهمیت ویژه¬ای در رادیوتراپی سرطان دارد. به سلول بازمانده¬ای که قابلیت تولیدمثل را حفظ نموده و با تکثیر نامحدود، یک کلون بزرگ یا کلونی را تشکیل دهد که کلوژنیک یا کلونی¬زایی نامیده می¬شود. برای بیشتر سلول¬ها که برای تقسیم سلولی تلاش می¬کنند، مرگ میتوزی روند غالبی پس از پرتوگیری می¬باشد. در برخی موارد سلول مجبور به طی کردن روند مرگ برنامه¬ریزی شده آپوپتوز می¬شود. در هر حال نتیجه تمامی روندهای گفته شده، از دست دادن توانایی تقسیم نامحدود، یعنی قابلیت تولیدمثل سلول است. برای ایجاد مرگ در سلول¬های متمایز که دچار مرگ عملکردی می¬شوند دزی حدود 100 گری ولی برای ایجاد مرگ میتوزی در سلول¬های نامتمایز کمتر از 2 گری کافی است. هدف از این مطالعه، بررسی درمان ترکیبی داروی ضد سرطان برومیلین و رادیوتراپی در سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) در شرایط آزمایشگاهی بود. اثر ضد سرطان برومیلین در تعداد محدودی از مطالعات بررسی شده است. مطالعات فوق بر روی تعدادی از سلول¬های سرطانی موشی و انسانی نظیر ملانوما، کولون و معده بررسی شده و نشان داده است که اثرات ضدسرطانی برومیلین به دلیل ترکیبات پروتئاز آن است. Chang و همکاران (2019)، اثر برومیلین بر مهارکردن تکثیر سلول‌های سرطانی کولورکتال از طریق فعالسازی گونه‌های اکسیژن واکنش پذیر (ROS)، سوپراکسیدها و اوتوفاژی مطالعه کردند. مکانیسم ضد سرطانی برومیلین از طریق القاء گونه‌های اکسیژن واکنش پذیر، سوپراکسیدها، اوتوفاژوزوم‌ها و لیزوزوم‌ها در مدل موشی و zebrafish می‌باشد. برومیلین، همچنین باعث القاء آپوپتوزمی‌شود (19). Wang و همکاران (2018) ، اثر نانوذرات کیتوسان اصلاح شده با برومیلین و لاکتوبیونیک اسید به عنوان حامل دوکسوروبیسین برای افزایش نفوذ دارو در بافت‌های سرطانی بررسی کردند. بر اساس نتایج این مطالعه، برومیلین باعث افزایش نفوذ نانو ذرات کیتوسان در ناحیه سرطانی شده که منجر به افزایش غلظت بیشتر دارو در ناحیه سرطانی می‌شود و اثر ضد سرطانی دارو بهبود می یابد (20). Amini و همکاران (2016)، اثر برومیلین و ان-استیل سیستئین با داروهای ضد سرطان دیگر بر روی سلول‌های سرطانی معده –روده ای نوع انسانی بررسی کردند. بر اساس نتایج این مطالعه، ترکیب برومیلین و ان-استیل سیستئین با داروهای ضد سرطان دیگر مانند سیسپلاتین، پاکلی تاکسل، 5-فلوئورواوراسیل و وینکریستین می‌توانند باعث بهبود شاخص شیمی درمانی برای بدخیمی‌های دستگاه گوارش با سمیت کمتر و دوزهایی که بیمار تمایل بیشتری برای مصرف دارد شوند (21). Amini و همکاران (2014)، اثر برومیلین را بصورت درمان تنها و یا در ترکیب با ان-استیل سیستئین بر روی سلول‌های سرطانی معده-روده‌ای نوع انسانی بررسی کردند براساس نتایج این مطالعه، برومیلین در درمان تک و یا ترکیبی اثر سیتوتوکسیک بر روی سلولهای سرطانی معده-روده با منشأ و فنوتیپ و حساسیت داروئی متفاوت دارد و مکانیسم اثر درمانی می تواند از طریق توقف سیکل سلول، آپوپتوز و اتوفاژی باشد. درمان ترکیبی برومیلین اثرات سیتوتوکسیک و مهار رشد بیشتری حاصل شده است (22). Pillaiو همکاران (2014)، اثر ضد سرطانی برومیلین را بصورت تنها و یا در ترکیب با داروهای شیمی درمانی 5-FU در سلولهای سرطانی مزوتلیوم صفاقی مطالعه کردند. برومیلین باعث کاهش بقای سلول‌های سرطانی فوق شده و مکانیسم اثر آن از طریق آپوپتوز و اتوفاژی است. در ترکیب با داروهای شیمی درمانی، سیتوتوکسیسیتی سلول های سرطانی را افزایش می‌دهد (23). در مطالعات انجام شده، اثر ضد سرطانی برومیلین در زمان انکوباسیون 72 ساعت بررسی شده بود و با توجه به دانش ما، تاکنون درمان ترکیبی داروی ضد سرطانی برومیلین و رادیوتراپی در سلولهای سرطانی نوع انسانی بررسی نشده است. در مطالعه حاضر، در ابتدا میزان بقای سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) در حضور برومیلین در رمان¬های انکوباسیون متفاوت 2 ساعت، 24 ساعت، 48 ساعت و 72 ساعت را نشان می¬دهد. بر اساس نتایج مطالعه، در زمان¬های انکوباسیون 24 ساعت، برومیلین در غلظت¬های بالای 600-50 میکروگرم بر میلی لیتر منجر به کاهش فراوان بقای سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) شد و در زمان انکوباسیون 48 ساعت، در غلظت¬های 600-40 میکروگرم بر میلی لیتر، بقای سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) کاهش یافت. نتایج حاصل از 24 ساعت انکوباسیون با مطالعه Bhui (24) و همکارانش در توافق بالا و با مطالعه Tysnes (25) در تضاد است. با توجه به دانش ما، در این مطالعه برای اولین بار زمان انکوباسیون 48 ساعت در سلول¬های سرطانی پروستات نوع انسانی مورد بررسی قرار گرفت. بعد از 72 ساعت انکوباسیون، در سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3)، غلظت¬های 600-40 میکروگرم بر میلی لیتر منجر به کاهش فراوان بقای سلول¬های سرطانی شد در مطالعات Amini و همکارانش، غلظت¬های بالای برومیلین (600-100 میکروگرم بر میلی لیتر) بعد از 72 ساعت، اثر سمیت بالایی در سرطان کولون ایجاد کرده ولی در غلظت¬های پایین بدون اثر سمی بود. در سرطان پروستات، در غلظت¬های بالا و پایین (40-600 میکروگرم بر میلی لیتر)، اثر سمیت بالایی از برومیلین گزارش دادند. نتایج مطالعه ما در غلظت¬های بالا مشابه با مطالعه فوق است. بر اساس نتایج مطالعه حاضر، در زمان¬های درمانی طولانی، برومیلین بر روی ژن¬های القاء کننده آپوپتوز اثر گذاشته و منجر به مرگ سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) می¬شود. در زمان انکوباسیون 2 ساعت، بقای سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) غلظت¬های متفاوت برومیلین، مانند زمان¬های 2، 48 و 72 ساعت انکوباسیون منجر به کاهش فراوان بقای سلول¬های سرطانی نشد. بر اساس نتایج اینگونه استنباط می¬شود که در زمان¬های انکوباسیون کوتاه، اثر سمیت بر سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) ندارند. با توجه به دانش ما، مطالعه¬ای بر روی زمان انکوباسیون کوتاه در سلول¬های سرطانی نوع انسانی صورت نگرفته است. نتایج تست کلونی¬زائی بعد از درمان با برومیلین و پرتو نشان داد که برومیلین با غلظت¬های 147 و 153 میکروگرم بر میلی لیتر قادر است در دوز 2، 4 و 6 گری سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) را به اثرهای کشنده پرتو حساس نماید. آپوپتوز القاء شده در سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153میکروگرم بر میلی‌لیتر با آپوپتوز القاء شده سلول‌های درمان شده با پرتو در دزهای 2 ،4 و 6 گری، اختلاف معنی‌داری دارد. یافته-های این مطالعه با نتایج مطالعات قبلی که رادیوتراپی را با دیگر مواد حساس کننده پرتویی استفاده نمودند در توافق می¬باشد. از اینرو بر اساس نتایج این مطالعه و مطالعات انجام شده برومیلین در زمان¬های طولانی انکوباسیون منجر به کاهش فراوان بقای سلول¬های سرطان پروستات انسانی (PC3) می¬شود، همچنین برومیلین در غلظت¬های 147 و 153 میکروگرم بر میلی¬لیتر در دوزهای 2، 4 و 6 گری بعنوان حساس کننده پرتویی بر روی سلول-های سرطان پروستات انسانی (PC3) عمل می¬نماید.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها در نمودارهای 4-1 تا 4-4 نتایج به¬صورت درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های (g/mlµ) متفاوت برومیلین و در زمان‌های متفاوت انکوباسیون (2، 24، 48 و 72 ساعت) آمده است. در زمان انکوباسیون 2 ساعت (نمودار 4-1)، بین غلظت‌های مختلف به‌کاربرده شده از برومیلین و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود ندارد (05/0P>). در زمان‌ انکوباسیون 24 ساعت (نمودار4-2)، بین غلظت‌های کم برومیلین (g/mlµ 5-40) و بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود نداشت (05/0P>) ولی در غلظت‌های بالای برومیلین (g/mlµ 50-600)، بقای سلول‌های PC3 به¬طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0P<). در زمان¬های انکوباسیون 48 و 72 ساعت (به ترتیب نمودار 4-3 و 4-4)، بین غلظت‌های کم برومیلین (g/mlµ 5-20) و بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌دار آماری وجود نداشت (05/0P>) لی در غلظت‌های بالای برومیلین (g/mlµ 40-600)، بقای سلول‌های PC3 به¬طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0P<). در نمودارهای 4-5 تا 4-10 نتایج به¬صورت مقایسه بین درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های (g/mlµ) متفاوت برومیلین به ترتیب در زمان‌های متفاوت انکوباسیون (2 و 24، 2 و 48، 2 و 72، 24 و 48، 24 و 72، 48 و 72 ساعت) آمده است. در غلظت‌های پایین و بالا (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 24 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-5). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 48 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (05/0P<) (نمودار 4-6). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 2 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-7). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 24 و 48 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (05/0P<) (نمودار 4-8). در غلظت‌های (g/mlµ 5-600)، بین زمان‌های انکوباسیون 24 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P<) (نمودار 4-9). در غلظت‌های متفاوت برومیلین، بین زمان‌های انکوباسیون 48 و 72 ساعت و درصد بقای سلول‌های PC3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0P>) (نمودار 4-10). در جدول 4-1 میزان درصد زیست پذیری (IC50) برومیلین بر روی سلول‌هایPC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت آمده است. میزان درصد زیست پذیری برومیلین بر روی سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب 1902، 147، 153 و g/mlµ 91 به دست آمد. نتایج مقایسه درصد زیست پذیری برومیلین بر روی سلول‌های PC3 نشان داد که بین میزان درصد زیست پذیری در زمان انکوباسیون 2 ساعت و میزان درصد زیست پذیری در زمان 24، 48 و 72 ساعت تفاوت معنی‌داری وجود دارد (05/0P<). بین میزان درصد زیست پذیری در زمان‌های انکوباسیون 24، 48 و 72 ساعت تفاوت معنی‌داری وجود ندارد (05/0P>) (جدول 4-2). نمودار 4-1. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 2 ساعت نمودار 4-2. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 24 ساعت نمودار 4-3. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 48 ساعت نمودار 4-4. تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌ انکوباسیون 72 ساعت نمودار 4-5. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 24 ساعت نمودار 4-6. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 48 ساعت نمودار 4-7. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 2 و 72 ساعت نمودار 4-8. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 24 و 48 ساعت نمودار 4-9. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 24 و 72 ساعت نمودار 4-10. مقایسه تغییرات درصد بقای سلول‌های PC3 برحسب غلظت‌های متفاوت برومیلین در زمان‌های‌ انکوباسیون 48 و 72 ساعت جدول 4-1. میزان IC50 برحسب میکروگرم بر میلی‌لیتر در سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت 72 ساعت 48 ساعت 24 ساعت 2 ساعت سلول زمان 91 153 147 1902 PC3 جدول 4-2. میزان P value در مقایسه بین میزان IC50 در سلول‌های PC3 در زمان‌های انکوباسیون 2، 24، 48 و 72 ساعت 72 ساعت 48 ساعت 24 ساعت 2 ساعت زمان P<05/0 P<05/0 P<05/0 2 ساعت P>05/0 P>05/0 P<05/0 24 ساعت P>05/0 P>05/0 P<05/0 48 ساعت در نمودار 4-11 نسبت بقای سلول‌های PC3درمان شده با پرتو در مقایسه با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر، آمده است. نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو در دزهای 2، 4 و 6 گری، اختلاف معنی‌داری دارد (05/0P<). نمودار 4-11. نسبت بقای سلول‌های PC3درمان شده با پرتو در مقایسه با نسبت بقای سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین در نمودارهای 4-12 آپوپتوز القاء شده در سلول‌های PC3درمان شده با پرتو، برومیلین و ترکیب درمان برومیلین و پرتو در مقایسه با سلول‌های کنترل نمایش شده است. آپوپتوز القاء شده در سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر با آپوپتوز القاء شده سلول‌های درمان شده با پرتو در دزهای 2 ،4 و 6 گری، اختلاف معنی‌داری دارد (05/0P<). 12-4. مقدار آپوپتوز سلول‌های PC3درمان شده با برومیلین تنها و پرتو تنها در مقایسه با مقدار آپوپتوز سلول‌های درمان شده با پرتو به همراه برومیلین با غلظت 153 میکروگرم بر میلی‌لیتر

فایل های پژوهش