پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله آناناس از زمانهای بسیارقدیم به عنوان بخشی ازطب سنتی مورداستفاده قرارمیگیرد و همچنان در داروهای گیاهی مختلف وجود دارد. برومیلین ترکیبی پیچیده ازآنزیمهای پروتئولیتیک ازجمله پروتئینازهای سیستئین و آنزیمهای غیرپروتئولیک وترکیبات متعدد دیگر ازجمله پراکسیدازها، اسیدفسفاتازها وگلیکوزیدازها است که از میوه یا ساقه گیاه آناناس استخراج میشود (1). برومیلین را میتوان به عنوان یک پروتئازطبقه بندی کرد زیرا به گروه آنزیم اطلاق میشودکه متعلق به عملکردکاتالیزوری است که پیوندهای پپتیدی پروتئینها را هیدرولیز میکند. برومیلین به دلیل سابقه استفاده بیخطر و عدم وجود عوارض جانبی، پذیرش جهانی را به عنوان یک عامل فیتوتراپی بدست آورده است. برومیلین کاربرد زیادی درصنایع دارد (4-2). برومیلین به دلیل داشتن خاصیت ضدالتهابی، ضدترومبوتیکی و فیبرینولیتیک، و اثرات سیستم ایمنی بدن علاوه براینکه باعث بهبود زخم و بهبود گردش خون میشود، به طورگسترده ای به دلیل خاصیت شناخته شده آن، دربیماریهای مختلفی ازجمله آنژین صدری، برونشیت، سینوزیت، استئوآرتریت، اسهال و انواع مختلف بیماریهای قلبی عروقی مورد استفاده قرار میگیرد (6،5). برومیلین نیز دارای فعالیت ضدسرطانی میباشد (7) و اثرات سیتوتوکسیک و سیتواستاتیک برروی آدنوکارسینومای پستانداران، لوسمی، لنفوما، سارکوما، ملانوما و سلولهای سرطانی اسیتیک (11-8) گلایوما (12) سرطان پستان (15-13) کارسینومای اپیدموئید، ملانوما (16)، کارسینومای معده، کولون (19-17) و مزوتلیوم بدخیم داخل صفاقی (17، 20) نشان میدهد. ازآنجا که برومیلین ازنظرتجاری و دارویی دارای اهمیت زیادی است، بنابراین حفظ و بهبود خواص برومیلین درساختار و فعالیت کاتالیزوری برای حفظ ارزشهای صنعتی و درمانی آن ضروری است. تعیین ساختار سوم پروتئین ها با استفاده از روش های آزمایشگاهی همیشه بهترین گزینه بشمار نمی رود زیرا علاوه بر آنکه این روش ها نیازمند صرف زمان و هزینه بالا هستند برای برخی از پروتئین ها قابل اجرا نمی باشند. امروزه روش های مبتنی بر همولوژی مدلینگ بدلیل آنکه سریع تر و کم هزینه تر از روش های آزمایشگاهی هستند از اهمیت بسیار بالایی برای تعیین ساختار پروتئین ها برخوردار می باشند (21). تعیین ساختار سوم پروتئین ها از بسیاری جهات حائز اهمیت فراوان است (22). بسیاری از ترکیباتی که امروزه به عنوان دارو برای درمان بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرند در واقع عملکرد خود را ازطریق میانکنش با یک پروتئین خاص انجام می دهند. بنابراین تعیین ساختار سوم یک پروتئین به فهم بهتر عملکرد آن پروتئین کمک شایانی می نماید (23). همولوژی مدلینگ، پیش گویی ساختارهای پروتئینی را بر اساس همولوژی توالی با ساختارهای شناخته شده انجام می دهد که مدل سازی مقایسه ای نیز نامیده می شود (24). همولوژی مدلینگ بر این واقعیت تکیه دارد که پروتئین هایی که از لحاظ تکاملی به هم مرتبط هستند ساختار مشابهی را نیز دارا می باشند. درحال حاضر، همولوژی مدلینگ روش انتخابی برای پیش بینی ساختار سه بعدی پروتئین با توجه به توالی پروتئین است. مدل سازی همولوژی مبتنی بر این واقعیت است که توالیهای حفظ شده ساختارهای سه بعدی مشترک را به اشتراک میگذارند. به عبارت دیگر، تغییرات کوچک درتوالی معمولاً تاثیری درساختار سه بعدی ندارند. در این روش، ساختار سوم یک توالی پروتئینی خاص (هدف: target) از طریق همترازسازی آن با توالی یک یا بیش از یک پروتئین با ساختار مشخص (الگو: template) پیش بینی می شود. در همولوژی مدلینگ، کلیه ساختارهای پروتئینی مرتبط با توالی هدف تشخیص داده می¬ شود و از بین ساختارهای پروتئینی، الگوهای مناسب انتخاب می¬شوند و مدل¬های سه بعدی از پروتئین مورد نظر ساخته می شود (27-25). بنابراین، حتی اگرروشهای زیادی برای تقویت استخراج، تصفیه، شرایط بهینه و فعالیت خاص برومیلین برای بسترهای مختلف کشف شده باشد اما به دلیل ساختار سه بعدی ناشناخته، مکانیسم این آنزیم هنوز مورد سوال است. Omotoyinbo و همکاران (2018)، طی مطالعه ای به بررسی in silico برومیلین از ساقه و میوه آناناس پرداختند و نتایج این بررسی نشان می دهد که نقطه ایزوالکتریک برومیلین از ساقه 436/8 می باشد درحالیکه برومیلین از میوه 726/4 است. آنالیز فیلوژنتیک نشان داد که توالی آمینو اسیدها بین دو تا آنزیم تقریبا مشابه است و رابطه نزدیکی با هم دارند. ساختار دوم این ساختارهای مدل برای برومیلین از ساقه و میوه آناناس عمدتا شامل مارپیچ ها و رشته های بتا می باشد (28). Mohamed Tap و همکاران (2018)، اثر بازدارندگی کمپلکس برومیلین و ترکیبات فیتوشیمی بر روی فسفولیپازA2 (Pla2) با دو روش in vitro و in silico مورد بررسی قرار دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که برومیلین و آمنتوفلاوون اثرات آنتاگونیستی بر روی Pla2 دارند. برومیلین- اسیتیکوزید وبرومیلین- دیوسجنین اثرات هم افزایی با غلظت های بالایی از این ترکیبات و با درصد مهاری بیشتر از 70 % و 90 % و اثرات آنتاگونیستی در غلظت های پایین نشان می دهند. اثرات هم افزایی این ترکیبات، یک کاربرد جدید در درمان التهاب را نشان می دهند (29). Hussein (2018)، به مطالعه اثر ضد سرطانی آنزیم برومیلین برای مهار لوسمی به صورت in silico پرداخته است. نتایج این مطالعه نشان می دهد که با استفاده از همولوژی مدلینگ ساختار سه بعدی برومیلین پیش بینی شده است و در فرایند داکینگ بین برومیلین و پروتئین receptor foe advanced glycation end- products (RAGE)، میزان انرژی بهینه باندینگ بین این دو kcal/mol 367/94- می باشد و از آنجا که انرژی اتصال بسیار کمتری یافت می شود ، چنین استنباط می شود که RAGE به عنوان گیرنده مناسبی برای فعالیت داکینگ برومیلین عمل می کند که شواهدی از فعالیت ضد سرطانی برومیلین ارائه می دهد (30). Mohamed Tap و همکاران (2017)، ساختار سوم برومیلین از آناناس را با استفاده از روش مدلینگ مقایسه ای مورد بررسی قرار دادند. بر اساس نتایج این مطالعه، پروتئین کموپاپایین به عنوان الگو با بالاترین همسانی توالی اسید امینه ( 55 %) و بامقدار 9 e-value52-10 انتخاب شده است (31). Mohamed Tap و همکاران (2016)، پیش بینی ساختار برومیلین در ساقه آناناس با استفاده از آنزیم پروکاریسین به عنوان الگومورد بررسی قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داده است که ساختارسه بعدی برمیلین با استفاده ازمدلهای همسانی باپروکاریسین به عنوان الگوی مدل سازی پیش بینی شده است. مشخص شدکه مارپیچ هاعنصراصلی ساختار ثانویه برومیلین هستند. برای دستیابی به ترکیب پایدار، ناحیه توالی که از Ser25 تا Asp50 را پوشش میدهد، باید بیشتر مورد بررسی قرار گیردو تحقیقات بیشتر و ارزیابی کیفیت برای اصلاح و اعتبار این ساختار موردنیاز است (32). Wang و همکاران (2014)، خواص عملکردی پروتئیناز سیستئین از آناناس میوه با مقاومت بهبود یافته در برابر پاتوژنهای قارچی Arabidopsis thaliana را مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه،AcCP2 ، یک سیستئین پروتئیناز متعلق به زیر خانواده CA1 از میوه آناناس جدا شد. حوزه های عملکردی این پروتئین بر اساس مدل سازی مولکولی و تراز همسانی مورد بررسی قرار گرفت. رونوشت های AcCP2 را می توان در قسمت های مختلف میوه (بخصوص سارکوکارپ های خارجی) کشف کرد و به تدریج در طول رشد میوه تا تکامل افزایش می یابد. این داده ها نشان می دهد که AcCP2 یک پروتئیناز چند منظوره است ، و بیان آن می تواند باعث ویژگی های رشد میوه از پاسخ آناناس و مقاومت در گیاهان Arabidopsis تراریخته شود (33). روش اجرا مطالعات همولوژی مدلینگ و داکینگ مولکولی داروهای ضد سرطان دوستاکسل و 5- فلوئورواوراسیل وآنتی اکسیدان ان- استیل سیستئین با برومیلین با استفاده ازسرورهای اینترنتی و نرم افزارهای Uniprot، BLAST، Swiss model و MOE مورد بررسی قرار گرفت. به منظور تعیین توالی ساختار سوم برومیلین، ابتدا توالی این آنزیم از پایگاه uniprot با شماره شناسایی P14518 در فرمت FASTA دریافت شد. با استفاده از ابزار BLASTP در پایگاه Protein Data Bank RSCB، پروتئین Carica papaya chymopapain از carica papaya(PDB ID: 1YAL) با رزولوشن Å 70/1 بسیار شبیه به برومیلین بوده و به عنوان الگویی برای مدل سازی انتخاب شد. پس از انتخاب الگو، همولوژی مدلینگ با استفاده از پایگاه swiss model انجام ومدل پیشنهادی با ابزار بیوانفورماتیک مناسب شامل نمودار راماچاندران، ProsaوERRAT ارزیابی شد. پس از انجام همولوژی مدلینگ، مطالعات داکینگ داروهای ضد سرطان دوستاکسل و 5- فلوئورواوراسیل وآنتی اکسیدان ان- استیل سیستئین بر روی پروتئین مدل برومیلین با استفاده از نرم افزارMOE انجام شد و نتایج داکینگ مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج پیش بینی شده در این مطالعه شبیه سازی شده ، با اهداف کاربردی در انجام آزمایشات in vitro و در ادامه در کارآزمایی های بالینی مورد استفاده قرار میگیرد و همینطور به منظور بررسی مطالعات مربوط به بیماری سرطان مورد استفاده قرار خواهند گرفت تا بتوان مسیرهای مطالعاتی آینده را با نگرش های مولکولی و دینامیک مولکولی تدوین نمود. یافته ها پروتئین برومیلین فاقد ساختار کریستالوگرافی در بانک داده پروتئین (RCSB) می‌باشند. عدم وجود ساختار برای این پروتئین ، مدل‌سازی آن را ضروری می‌سازد تا در فرایند داکینگ استفاده شود. برای این منظور توالی پروتئین برومیلین با فرمت FASTA (Uniport ID: P14518) از پایگاه داده Uniprot به دست آمد. الگوی مناسب با ارسال توالی FASTA به ابزارهای سرور BLAST و Phyre2 تعیین شد. 1YAL، به‌عنوان پروتئین الگو با همسانی توالی 70/50% وE-value آماری 3e-67 با برومیلین انتخاب شد. ساختار مدل‌ برومیلین با استفاده از Swiss model (35) با GMQE، 84/0 و QMEAN، 45/1- ایجاد شد. صحت استرئو شیمیایی مدل برومیلین توسط نمودار راماچاندران و ارقام نمودار راماچاندران مشخص شد و نمودار راماچاندران نشان می‌دهد که برای مدل پیش‌بینی‌شده اکثر اسیدهای آمینه در نواحی مطلوب و مجاز قرارگرفته‌اند و نشان‌دهنده کیفیت خوب استرئوشیمیایی مدل است. ارزیابیProsa مدل برومیلین با Z-score برابر با 99/6- واجد شرایط دانست که اینscore در محدوده پروتئین‌های PDB تعیین‌شده توسط کریستالوگرافی اشعه X (منطقه آبی روشن) و طیف‌سنجیNMR (منطقه آبی تیره) مدلی باکیفیت خوب را پیش‌بینی می‌کند. در این مطالعه، (935/92) scoreERRATنشان می‌دهد که کانفورماسیون backbone و تعاملات غیر پیوندی مدل قابل‌قبول است. آنالیز نتایج داکینگ نشان می‌دهد که score‌های داکینگ 95/6- ، 24/5- و 30/6- kcal/mol را به ترتیب برای دوستاکسل، 5-فلوئورواوراسیل ان-استیل سیستئین با برومیلین می‌باشد. ترکیبات دوستاکسل، 5-فلوئورواوراسیل و ان-استیل سیستئین در جایگاه فعال برومیلین به‌خوبی تثبیت شد و برهمکنش‌های قابل‌توجهی با آمینواسیدهای کلیدی این پروتئین داشتند. بحث و نتیجه گیری مطالعات گذشته نشان می دهد برومیلین عصاره آناناس بوده و شامل آنزیم های پروتئولیک حاوی سولفیدریل، آنزیم های غیر پروتئولیک وترکیبات متعدد دیگر می باشد (37). برومیلین در فعالیت هایی نظیر هضم، ترمیم زخم، دبریت های سوختگی و افزایش جذب آنتی بیوتیک نقش موثری ایفا می کند. برومیلین هم چنین دارای فعالیت های تنظیم کننده سیستم ایمنی، ضد التهاب می باشد و دارای فعالیت ضد سرطانی می باشد (7). برومیلین از طریق مسیرهای متفاوتی می تواند بدخیمی ها را کنترل کند و از طریق اثر مستقیم بر سلول های سرطانی و یا محیط پیرامون سرطان و یا اثر غیر مستقیم بر تعدیل کننده های سیستم ایمنی، عفونی و خونساز این عمل را انجام می دهد. برومیلین در ترکیب با دیگر داروهای ضد سرطانی مانع رشد، تکثیر و بقای سلولهای سرطانی می شود (17)و اثر هم افزائی در درمان را موجب می شود. در مطالعه ای، امینی و همکاران اثر برومیلین و ان-استیل سیستئین با داروهای ضد سرطان دیگر بر روی سلول های سرطانی معده –روده ای نوع انسانی بررسی کردند. بر اساس نتایج این مطالعه، ترکیب برومیلین و ان-استیل سیستئین با داروهای ضد سرطان دیگر مانند سیسپلاتین، دوستا کسل، 5-فلوئورواوراسیل و وینکریستین می توانند باعث بهبود شاخص شیمی درمانی برای بدخیمی های دستگاه گوارش با سمیت کمتر و دوزهایی که بیمار تمایل بیشتری برای مصرف دارد شوند (38). Pillai وهمکاران در مطالعه دیگر اثر ترکیب بهینه برومیلین و ان-استیل سیستئین برای درمان آسیت موسین وس حاصل از سرطان Pseudomyxoma peritonei بررسی کردند. بر اساس نتایج این مطالعه سلولی و حیوانی، ترکیب برومیلین و ان-استیل سیستئین موجب از بین رفتن موسین در 72 ساعت شده و هیچ گونه سمیتی مشاهده نشده است (39). مطالعه حاضر که بر مبنای مطالعات همولوژی مدلینگ و داکینگ مولکولی انجام شده است بیانگر این موضوع است که برومیلین می تواند براساس اینکه عصاره آناناس می باشد و دارای ساختار پروتئینی است می تواند بر روی سلول های سرطانی تاثیر گذار باشد. برومیلین با تاثیری که بر رفتار داکینگ مولکولی داروهای ضد سرطان و آنتی اکسیدان ان-استیل سیستئین می گذارد و در ترکیب با این داروها و انتی اکسیدان ها اثر هم افزائی بر روی سلول های سرطانی دارد. نتایج داکینگ مولکولی برومیلین و دوستا کسل، 5-فلوئورواوراسیل و ان- استیل سیستئین در تصاویر 3-4-5 الی 3-4-7 نشان می دهد که این ترکیبات در جایگاه فعال برومیلین به خوبی تثبیت شدند واین می تواند نشانه ای از افزایش اثر هم افزایی برومیلین و داروهای ضد سرطان و آنتی اکسیدان ها باشد و در نهایت می تواند در مهار سلول های سرطانی و درمان سرطان موثر باشد.

خلاصه نتایج حاصله

پروتئین برومیلین فاقد ساختار کریستالوگرافی در بانک داده پروتئین (RCSB) می‌باشند. عدم وجود ساختار برای این پروتئین ، مدل‌سازی آن را ضروری می‌سازد تا در فرایند داکینگ استفاده شود. برای این منظور توالی پروتئین برومیلین با فرمت FASTA (Uniport ID: P14518) از پایگاه داده Uniprot به دست آمد. الگوی مناسب با ارسال توالی FASTA به ابزارهای سرور BLAST و Phyre2 تعیین شد. 1YAL، به‌عنوان پروتئین الگو با همسانی توالی 70/50% وE-value آماری 3e-67 با برومیلین انتخاب شد. ساختار مدل‌ برومیلین با استفاده از Swiss model (35) با GMQE، 84/0 و QMEAN، 45/1- ایجاد شد. صحت استرئو شیمیایی مدل برومیلین توسط نمودار راماچاندران و ارقام نمودار راماچاندران مشخص شد و نمودار راماچاندران نشان می‌دهد که برای مدل پیش‌بینی‌شده اکثر اسیدهای آمینه در نواحی مطلوب و مجاز قرارگرفته‌اند و نشان‌دهنده کیفیت خوب استرئوشیمیایی مدل است. ارزیابیProsa مدل برومیلین با Z-score برابر با 99/6- واجد شرایط دانست که اینscore در محدوده پروتئین‌های PDB تعیین‌شده توسط کریستالوگرافی اشعه X (منطقه آبی روشن) و طیف‌سنجیNMR (منطقه آبی تیره) مدلی باکیفیت خوب را پیش‌بینی می‌کند. در این مطالعه، (935/92) scoreERRATنشان می‌دهد که کانفورماسیون backbone و تعاملات غیر پیوندی مدل قابل‌قبول است. آنالیز نتایج داکینگ نشان می‌دهد که score‌های داکینگ 95/6- ، 24/5- و 30/6- kcal/mol را به ترتیب برای دوستاکسل، 5-فلوئورواوراسیل ان-استیل سیستئین با برومیلین می‌باشد. ترکیبات دوستاکسل، 5-فلوئورواوراسیل و ان-استیل سیستئین در جایگاه فعال برومیلین به‌خوبی تثبیت شد و برهمکنش‌های قابل‌توجهی با آمینواسیدهای کلیدی این پروتئین داشتند.

فایل های پژوهش