پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله در انتهای ماه دسامبر 2019، نوع جدیدی از ویروس کرونا در منطقه ووهان چین شناسایی شد. پس از آن ویروس از طریق سرایت انسان به انسان به سرعت در سراسر چین منتشر گردید(1). در تاریخ 11 مارچ 2020، سازمان بهداشت جهانی خبر از پاندمیک شدن شیوع ویروس کرونای جدید داد و تا تاریخ 14 آوریل 2020، 1844863 بیمار تایید شده و 117021 مرگ 117021 در 213 کشور و ایالت گزارش شده است(2). ویروس جدید کرونا با نام شناخته شده COVID-2019 یک ویروس مشترک بین انسان و حیوان بوده و عامل ایجاد بیماری تنفسی شدید می باشد. گزارش های موجود حاکی از آن است که ویروس جدید نه تنها منجر به عفونت تنفسی شده بلکه توانایی درگیر و آسیب بافت های کبد و کلیه و قلب و مجرای گوارشی را دارد(3) در حال حاضر دارو یا واکسن برای درمان بیماری کرونا وجود ندارد. لذا با توجه به وضع بحرانی موجود، تلاش فوری و گسترده محققین جهت شناسایی دارو و درمان موثر مورد نیاز می باشد. لازم به ذکر است که استراتژی های درمانی موجود صرفا جنبه پیشیگیرانه و حمایتی داشته تا در صورت وقوع بیماری از ایجاد آسیب و عوارض ثانویه جلوگیری گردد(4). اخیرا تعدادی از مطالعات اثرات داروهای ضد HIV را به تنهایی و یا به صورت ترکیبی با سایر داروها از قبیل داروی ضد مالاریا علیه ویروس کرونا مورد مطالعه قرار داده اند(5). همچنین Xu و همکاران مطالعات دینامیک مولکولی بر روی داروهای praziquante، pitavastatin، perampanel و nelfinavir جهت پیش بینی اثرات مهاری این داروها روی پروتئاز اصلی ویروس کرونا مورد مطالعه قرار دادند. نتیجه مطالعه ی آن ها حاکی از آن بود که از میان آن چهار دارو، داروی nelfinavir بیشترین اثر مهاری را علیه پروتئاز اصلی COVID-19دارد(6). در 11 ژانویه 2020، دانشمندان ژنوم ویروس را جداسازی و توالی یابی نمودند(7). این ویروس دو پروتئاز به نام های پروتئاز شبه کیموتریپسین (3Clpro) و پروتئاز شبه پاپایین (PLpro) دارد که برای بقای ویروس در میزبان ضروری می باشند(8). پلی پروتئین 1a/b توسط ویروس کد می گردد و در نتیجه شکست پروتئولیتیک توسط پروتئازهای 3Clpro و PLpro، پروتئین های عملکردی تولید می شوند که در عفونت رونویسی و تکثیر ویروس نقش دارند(9). پروتئاز3Clpro (پروتئاز اصلی ویروس)، یک پروتئین حیاتی جهت فرایند پروتئولیز و بلوغ ویروس می باشد. همچنین Wang و همکاران ساختار کریستالی پروتئاز اصلی ویروس کرونا جدید را تهیه نمودند و یافته های مطالعه آن ها حاکی از آن هست که هدف گیری و مهار این پروتئاز می تواند یک داروی احتمالی علیه عفونت ویروس کرونا باشد(10) غربالگری بر مبنای مطالعات In-silico از جمله سودمندترین روش ها برای شناسایی داروهای ضدویروسی جدید می باشد. غربالگری محاسباتی ترکیبات دارویی و گیاهان دارویی با استفاده از مطالعات داکینگ مولکولی، سبب صرفه جویی در زمان و هزینه و کاهش خطاهای احتمالی مربوط به کارآزمایی های بالینی می گردد(11, 12). در دهه اخیر، تعداد زیادی گیاه دارویی با خاصیت درمانی کشف شده اند. مشخص شده است که اثرات ضدویروسی این ترکیبات از طریق ظرفیت انتی اکسیدانی و اثرات مهاری آن ها بر روی سنتز DNA و RNA میانجی می گردد. از این گذشته، این ترکیبات به دلیل فراهمی زیستی بالا و سمیت سلولی پایین شان به عنوان یک کاندید انتخابی احتمالی برای طراحی داروهای ضدویروسی مطرح می باشند(13). اگرچه هیچ درمان ضد ویروسی برای پیشگیری و درمان این بیماری تأیید نشده است؛ اما تاکنون اثرات مثبتی از آلفا-اینترفرون، لوپینوویر (lopinavir/ritonavir)، مهار کننده های آنزیم ورود ویروس به سلول همچون مهار کننده آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE-2 blockers) و مهار کننده های نوروآمینیداز ویروسی (neuraminidase inhibitors) و نیز مهارکننده های سنتز اسید نوکلئیک ویروسی از جمله لامیودین (Lamivudine)، تنوفوویر دیزوپراکسیل (tenofovir disoproxil)، رمیدسیویر (Remedesivir) و کلروکین (Chloroquine) در بهبود بیماری دیده شده است(14-18) با اینحال به دلیل وجود عوارض جانبی مشاهده شده برای درمان ها و داروهای کنترل کننده موجود و عدم کارآیی کامل آن ها، لزوم کشف داروهایی موثر و بدون عارضه جانبی برای ریشه کن کردن این بیماری احساس می شود. در این بین مطالعات دینامیک مولکولی در محیط های شبیه سازی شده می توانند به صورت در دسترس و با کمترین هزینه ها شرایطی را فراهم نمایند که محققین اطلاعات مفیدی را در خصوص پیش گویی نحوه عملکرد ترکیبات دارویی جدید بر روی عامل بیماری کسب کنند و در طراحی داروهای موثر مورد استفاده قرار دهند. این مطالعات علاوه بر اینکه میزان تمایل اتصال دارو به جایگاه اتصال پروتئین های درگیر در بیماری را نشان می دهند می توانند آمینواسیدهای موجود در جایگاه اتصال پروتئین های درگیر را شناسایی کرده و به طور کاملا اختصاصی فاکتور های مرتبط با دینامیک مولکولی پروتئین را قبل از مرحله اتصال دارو به Binding site و بعد از مرحله اتصال دارو به پروتئین و تفاوت ایی که ایجاد می شود را بیان می کنند و در طراحی داروها کمک رسان باشند(19) نتایج یک آزمایش binding حاکی از آن هست که دلفینیدین از طریق کاهش اتصال ویروس هپاتیت C به سطح سلول سبب کاهش عفونت ایجادی توسط این ویروس در سلول ها می گردد(20). سینامالدئید یکی از اجزای اصلی روغن دارچین در طب سنتی چینی است. در طول 30 سال گذشته ، بسیاری از مطالعات نشان داده اند که سینامالدئید دارای بسیاری از اثرات دارویی و سمیت پایین است. Hayashi و همکاران نشان دادند که سینامالدئید رشد ویروس آنفلوانزا PR8را در رده سلولیMDCK به شیوه ای وابسته به غلظت بدون آسیب سلولی مهار می کند. آن ها همچنین نشان دادند که در موش های آلوده به ویروس آنفلوانزا PR-8، استنشاق سینامالدئید (50 میلی گرم در قفس در روز) و تلقیح بینی (250 میکروگرم بر / موش / روز) به طور قابل توجهی میزان بقا را در 8 روز بعد از ایجاد عفونت نسبت به گروه کنترل افزایش میدهد(21). گالیک اسید یا تری هیدروکسی بنزوئیک اسید یکی از فراوان ترین اسیدهای فنلی در گیاهان است. این ترکیب کریستالی بی رنگ یا کمی زرد رنگ است و کاربرد گسترده ای در صنایع غذایی و دارویی دارد. گالیک از گونه های مختلف گیاهی مانند گونه های Quercus و Punica به طریق کروماتوگرافی جدا شده است(22). در موش هایBALB/c آلوده به ویروس آنفلوانزا ، تجویز خوراکی تمشک سیاهو گالیک اسید باعث افزایش معنی داری میزان بقا و کاهش تیترهای ویروسی در ریه ها شد. همچنین در این مطالعه بیان گردید که تمشک سیاه و گالیک اسید فعالیت ضد ویروسی قوی و گسترده ای را در برابر ویروس های آنفولانزایA و B نشان می دهند و منابع امیدوار کننده ای از عوامل موثر در برابر ذرات ویروس هستند(23) p-Cymene وcarvacrol مونوترپنهای معطر بوده و از از لحاظ ساختاری مرتبط با هم هستند که از روغنهای گونه های مختلف گیاهی به دست می آیند. کارواکرول به دلیل وجود یک گروه هیدروکسیل متصل به حلقه معطره و امکان تثبیت تشکیل رادیکالهای آزاد به یک کلاس از آنتی اکسیدان های طبیعیاست که از پراکسیداسیون لیپیدها جلوگیری می کند. سایمن ساختار مشابهی با کارواکرول دارد اما گروه هیدروکسیل در حلقه معطر وجود ندارد(24). مطالعات نشان داده اند که این ترکیبات، فعالیتهای بیولوژیکی متفاوتی از جمله فعالیت های ضد توموری ، ضد باکتریایی ، ضد قارچ ، ضد التهابی و آنتی اکسیدان را دارا می باشند(25, 26). در مطالعه صورت گرفته توسط Sharifi-Rad و همکاران، اثر مهاری مونوترپن های تیمول، کارواکرول و سایمن علیه ویروس هرپس تایپ 1 در محیط invitro بر روی رده های سلولی CCL-81-ATCC مورد ارزیابی قرار گرقت. نتایج مطالعه تاییدکننده فعالیت ضدویروسی این سه مونوترپن بوده است و دانشمندان بیان نمودند که اثر این ترکیبات بر روی ویروس احتمالا از طریق برهکنش با پوشش ویروس می باشد(27) ویروس عامل بیماری کرونا، همانند عامل بیماری سارس از گروه βCoV-2 بوده و بنابراین جز ویروس های RNA دار رده مثبت پوشش دار با نوکلئوکپسید محسوب می شود(14). معمولاً بتا-کروناویروس ها پس از رونویسی از ژنوم، یک پلی پپتید 800 کیلو دالتونی تولید می کنند. این پلی پپتید برای تولید پروتئین های مختلف به صورت پروتئولیتیکی شکسته می شود. پردازش پروتئولیتیک این پروتئین توسط پروتئازی شبیه پاپائین (PLpro؛ papain-like protease) و پروتئاز 3-شبیه کیموتریپسین (3CLpro؛3-chymotrypsin-like protease) انجام می شود. 3CLpro پلی پروتئین اصلی ویروس را در 11 محل مجزا می شکند تا پروتئین های غیر ساختاری متنوعی که برای تکثیر ویروسی مهم هستند را تولید کند. 3CLpro نقش مهمی در تکثیر ذرات ویروس دارد و می تواند به عنوان یک هدف بالقوه برای تولید داروهای مهارکننده های ضد ویروس کرونا استفاده شود.(28) لذا در این مطالعه 3CLpro با استفاده از مطالعات دینامیک مولکولی مورد بررسی قرار گرفته است تا در مطالعه ای شبیه سازی شده اثر برخی ترکیبات موثر با ویژگی های آنتی ویروسی شامل (Cinnamaldehyde , Catechin, Coumarin, Cyanidin, Delphinidin, Fisetin, Gallic Acid, Genistein, Isorhamnetin, Liquiritigenin, p-Cymene, Piperine, Pterostilbene, Glabridin, Silibinin) بر روی عامل تکثیر ویروس کرونا بررسی و در طراحی داروهای ضد ویروسی بر علیه این بیماری مورد بررسی قرار گیرد. با توجه به شیوع بالای ویروس کرونا و جهانی شدن این بیماری، برخی محققین در پی کشف ترکیبات دارویی جدید در جهت پیشگیری و درمان این بیماری به مطالعات شبیه سازی مولکولی روی آورده اند. مطالعه ای در سال 2020 با هدف ارزیابی گیاهان دارویی چینی با پتانسیل مهار مستقیم کرونا ویروس جدید انجام شده است. در این مطالعه در اولین گام با استفاده از مروری بر منابع اقدام به شناسایی ترکیبات طبیعی با قابلیت درمان عفونت های تنفسی و نیز کرونا ویروس جدید با قابلیت القای پنومونی شده است. سپس در مرحله بعد ترکیباتی که احتمال اثربخشی بر روی این ویروس را داشته اند با استفاده از مطالعات شبیه سازی مولکولی اثرشان را بر روی پروتئین های گیرنده ویروس و تکثیر آن شامل PLpro، 3CLpro و Spike بررسی نموده اند. نتایج این مطالعه نشان داده که 13 ترکیب گیاهی از گیاهان دارویی چینی پتانسیل درمانی برای درمان کرونا ویروس جدید دارند(17) در مطالعه ای دیگر در سال 2020 ul Qamar و همکاران با بررسی پایگاهی از ترکیبات حاصل از گیاهان دارویی چینی که دارای اثرات ضد ویروسی بوده اند اثرات این ترکیبات را بر روی مهار پروتئین 3CLpro ویروس کرونا ارزیابی و نشان داده اند که در میان این ترکیبات 12 ترکیب فیتوشیمیایی اثرات موثرتری در اتصال به گیرنده 3CLpro ویروس کرونا داشته اند(14). در مطالعه ای شبیه سازی شده در سال 2008 اثرات لوپیناویر (lopinavir) و ریتوناویر (ritonavir) دو مهار کننده پروتئیناز ویروس اچ آی وی بر روی 3CLpro بررسی گردید. این مطالعه نشان داد در اتصال داروی لوپیناویر به 3CLpro تعداد 6 باند هیدروژنی و ریتوناویر با 7 پیوند هیدروژنی به آنزیم متصل می گردد. با اینحال نتایج اختلاف معنی داری در اتصال دو مهارکننده به جایگاه اتصال گیرنده وجود نداشت(29). در مطالعه ای در سال 2015، اثر 19 ترکیب مهارکننده آنزیم 3CLpro به منظور غربالگری بصری این ترکیبات و مطالعه طراحی داروهایی مبتنی بر ساختار آنها با استفاده از مطالعات شبیه سازی مولکولی انجام شده است. نتایج این مطالعه ترکیبات را بر اساس شکل و ویژگی های آنها در 15 خوشه متفاوت تقسیم بندی نموده است که می توانند به عنوان پایه ای برای آزمایش های آینده کشف مهار کننده ضد ویروس کرونا استفاده شوند(30) روش اجرا این مطالعه شبیه سازی شده که در پژوهشکده علوم پایه سلامت دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد انجام شد، در ابتدا به منظور انجام مطالعات مربوط به شبیه سازی و دینامیک مولکولی آنزیم CLpro3، ساختار ماکرومولکولی پروتئین CLpro3 را از سایت Protein data bank با کد ID: 6LU7 بدست آورده و ساختار هر کدام از ترکیبات موثره گیاهی را از سایت NCBI مطابق کد CID زیر بدست آورده و توسط نرم افزار Avogadro به فایل PDB تبدیل کردیم. Carvacrol (CID; 10364), Catechin (CID; 9064.), Cinnamaldehyde (CID; 637511), Coumarin (CID; 323), Cyanidin (CID; 128861), Delphinidin (CID; 128853), Fisetin (CID; 5281614), Genistein (CID; 5280961), Glabridin (CID; 124052), Isorhamnetin (CID; 5281654), Liquiritigenin (CID;114829), Nelfinavir (CID; 64143), p-Cymene (CID; 7463), Piperine (CID; 638024), Pterostilbene (CID; 5281727), Silibinin (CID; 31553), Thymoquinone (CID; 1028) شبیه سازی دینامیک مولکولی پروتئین پاراکسوناز1 در آب: مطالعات مربوط به شبیه سازی دینامیک مولکولی ساختار پروتئینی آنزیم مذکور ابتدا در محیط آب انجام شد تا ساختار مربوطه تحت شرایط تغییرات دما، فشار و غلظت 140 میلی مولار قرار بگیرد و به حالت تعادل برسد. برای این منظور از نرم افزار Gromacs 4.6.1 و میدان نیروی G43A1 استفاده شد .در این مطالعه از مدل SPC216 استفاده شد(31). بر اساس استانداردهای موجود غلظت املاح سیستم را با افزودن مقادیر مورد نیاز یون Na و Cl به غلظت 140 میلی مولار رساندیم و تعداد یون مذکور را با حلال جایگزین کردیم. مسیرهای ذخیره شده در شبیه سازی به عنوان کنترل برای تجزیه و تحلیل پارامترهای ساختاری پروتئین CLpro3 در حضور لیگاندهای مورد استفاده قرار گرفتند(32) در ادامه بر روی فایل PDB خروجی از ساختار شبیه سازی شده در آّب، مطابق روش زیر داکینگ مولکولی انجام شد. داکینگ مولکولی برای داکینگ مولکلول های کوچک در ماکرومولکول ها نرم افزار Autodock 4.1 مورد استفاده قرار می گیرد. با استفاده از این برنامه می توان پیش بینی کرد که یک سوبسترا یا دارو چگونه در گیرنده قرار می گیرد و ساختار سه بعدی آن نیز نشان داده می شود. با استفاده از این برنامه لیگاندهای مورد مطالعه در کنار آنزیم CLpro3 جای گیری شده و مورد بررسی قرار گرفتند. برای انجام داکینگ از الگوریتم ژنتیک استفاده شد. در این روش با جابجا کردن لیگاند وچرخاندن آن اطراف پروتئین صورتبندی های جدید لیگاند در کنار پروتئین شناسایی شدند. برای این منظور تعداد 200 مرحله داکینگ در نظر گرفته شد. پایینترین سطح انرژی از برهمکنش بین لیگاند و آنزیم به عنوان مناسب ترین مرحله در انجام داکینگ محسوب شد و فایل های مورد نیاز برای انجام فرایند شبیه سازی از سایت ProDrug تهیه شدند(33). تعداد پیوندهای هیدروژنی و هیدروفوبی بین آنزیم CLpro3 و لیگاندهای مورد مطالعه بعد از داکینگ با نرم افزار Ligplot به دست آمدند. همچنین بعد از به دست آمدن نتایج داکینگ آنزیم پاراکسوناز1 طبق روش شبیه سازی دینامیک مولکولی در حضور لیگاندهای مورد مطالعه شبیه سازی شدند. شبیه سازی دینامیک مولکولی کمپلکس پروتئین لیگاند در آب در این مرحله شبیه سازی دینامیک مولکولی کمپلکس آنزیم CLpro3 با لیگاندهای مورد مطالعه در محیط آب مطابق روش بالا (شبیه سازی دینامیک مولکولی پروتئین CLpro3 در آب) انجام شد. و همانند قبل مسیرهای ذخیره شده در شبیه سازی برای تجزیه و تحلیل پارامترهای ساختاری کمپلکس مورد استفاده قرار گرفت. در پایان آخرین مرحله از محاسبات دینامیک مولکولی، مقادیر مربوط به میزان انرژی کل (Total Energy)، RMSD، RMSF، RG و انواع پیوندهای هیدروژنی، هیدروفیل و هیدروفوب مربوط به ساختارهای مورد مطالعه در مراحل مربوط به شبیه سازی دینامیک مولکولی پروتئین CLpro3 در آب و شبیه سازی دینامیک مولکولی کمپلکس پروتئین لیگاند در آب بر اساس دستورات موجود در نرم افزار گرومکس در محیط سیستم عامل لینوکس بدست آمده و نتایج حاصل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. یافته ها نتایج مربوط به مطالعات داکینگ مولکولی و میزان انرژی آزاد سازی (Estimated Free Energy of binding) هنگام اتصال هر کدام از ترکیبات به جایگاه اتصال آنزیم CLpro3 در جدول شماره 3-4-1 نشان داده شده است. تعداد اسیدآمینه های موجود در جایگاه اتصال برای هرکدام از ترکیبات و نوع پیوند هیدروژنی یا پیوند هیدروفوب نشان داده شده است. از بین تمام ترکیبات مورد مطالعه به نظر می رسد که Catechin با 8.12 kcal/mol و Glabridin با 8.25 kcal/mol و Fisetin با 8.11 kcal/mol تمایل بسیار بالاتری نسبت به سایر ترکیبات برای اتصال با پروتئین CLpro3 دارند. این میزان انرژی آزاد شده در اثر اتصال این ترکیبات با پروتئین CLpro3 بسیار نزدیک با میزان انرژی آزاد شده در اثر اتصال مهار کننده Nelfinavir با 9.68 kcal/mol به پروتئین CLpro3 است. جدول شماره 3-4-1. نتایج داکینگ مولکولی Interaction bonds EIC µM FIE kcal/mol BE kcal/mol Ligand- receptor hydrophobic interactions Hydrogen Bonding Arg188, Gln189, His164, His41, Met165 Glu166 180.80 -5.70 -5.11 Carvacrol His164, Met165, Pro168, Thr190, Gln189, Arg188, His41, Gln192, Glu166, Tyr57, Asp187 1.13 -9.90 -8.12 Catechin His41, Asp187, Tyr54, Arg188, His164, Gln189, Met165 Glu166 454.11 -5.16 -4.56 Cinnamaldehyde Asn63, His64, Phe66, Gln74, Leu75, Leu67, Arg76 Val68, Val77, 139.43 -5.26 -5.26 Coumarin His41, Cys145, Met165, His164, Thr190, Ala191, Pro168, Gln189, Arg188 Asp187, Tyr54, Glu166, Gln192 1.64 -9.68 -7.89 Cyanidin Arg188, Gln189, Ala191, Thr190, Pro168, His164, Met165, His41 Tyr54, Asp187, Glu166, Gln192 2.31 -9.78 -7.69 Delphinidin Gln189, Thr190, Pro168, Ala191, Leu167, His41, Met165, Arg188, His164 Tyr54, Asp187, Gln192, Glu166 1.14 -9.60 -8.11 Fisetin Cys145, His164, Met165, Ala191, Leu167, Pro168, Glu166, Arg188, Gln189 His41, Gln192, Thr190 10.36 -7.99 -6.80 Genistein Thr26, Leu27, Cys145, His164, His41, Glu139, Met165, Leu141, Asn142 Glu166, Arg188, Gly143 0.90 -9.14 -8.25 Glabridin His164, Arg188, Gln189, Pro168, Ala191, Thr190, Leu167, Met165, His41, Tyr54, Gln192, Glu166, Asp187 2.63 -9.40 -7.61 Isorhamnetin Arg188, Gln189, Thr190, Ala191, Leu167, Pro168, Glu166, Met165, Asp187, His41, His164 Tyr54, Gln192, 2.77 -8.48 -7.58 Liquiritigenin Ala191, Arg188, His41, Met49, His164, Cys145, Met165, Asn142, His163, Ser144, Leu141, Gly170, Leu167, Pro168 Gln192, Thr190, Gln189, Glu166 0.08 -13.26 -9.68 Nelfinavir Arg217, Thr257, Ile213, Val303, Gln256, Thr304, Gln306, Phe305, Val212 ------------ 306.35 -5.09 -4.79 p-cymene Pro52, Tyr54, Met49, Cys44, His164, His41, Cys145, Met165, Asn142, Phe140, His163, Glu166, Ser144, Leu141, Arg188, Gln189, Asp187, Gly143 1.65 -8.78 -7.89 Piperine Glu166, Ser144, Cys145, Asn142, His41, Asp187, Met49, Gln189, Arg188, Met165, His164, Leu141, Phe140, Gly143, His167 2.60 -9.11 -7.62 Pterostilbene Gln189, Met165, Arg188, Pro168, Thr190, Ala191, Cys145, His164, His41 Glu166, Asp187, Tyr54 2.91 -10.24 -7.55 Silibinin Phe3, Arg4, Leu282, Glu288, Phe291 Lys5, Trp207 94.45 -5.79 -5.49 Thymoquinone Abbreviations: BE; Estimated Free Energy of binding (kcal/mol), EIC; estimated inhibition constant (μM). شکل شماره 3-4-1 محل اتصال هر کدام از ترکیبات موثره Catechin، Glabridin، و Fisetin را در محل اتصال پروتئین CLpro3 و همین طور جایگاه اتصال مهار کننده Nelfinavir را در محل اتصال با پروتئین CLpro3 نشان می دهد. هر سه ترکیب Catechin، Glabridin، و Fisetin تقریبا در جایگاه مشابهی با مهار کننده Nelfinavir در محل اتصال با پروتئین CLpro3 متصل می شوند. شکل شماره 3-4-1: محل اتصال هر کدام از ترکیبات موثره Catechin، Glabridin، و Fisetin در مقایسه با محل اتصال مهار کننده Nelfinavir در جایگاه اتصال پروتئین CLpro3. (A) Nelfinavir inhibitor, (B) glabridin, (C) catechin and (D) fisetin مقادیر مربوط به میزان root-mean-square deviation (RMSD) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-2 نشان داده شده است. هر چند که در پایان زمان شبیه سازی همه ترکیبات شامل پروتئین و پروتئین متصل به لیگاند به پایداری رسیده اند اما در طول زمان شبیه سازی شاهد یکسری نوسانات هستیم. این نتایج نشان می دهد که اتصال Catechin به پروتئین CLpro3 باعث کاهش در میزان RMSD مخصوصا در پایان زمان شبیه سازی می شود. اما در عین حال اتصال Glabridin به پروتئین CLpro3 باعث افزایش در میزان RMSD مخصوصا در پایان زمان شبیه سازی می شود. به نظر می رسد که اتصال Fisetin به پروتئین CLpro3 باعث ایجاد تغییری در میزان میانگین RMSD در طول مدت زمان شبیه سازی نمی شود. تصویر شماره 3-4-2 : مقادیر مربوط به میزان root-mean-square deviation (RMSD). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان انرژی کل Total Energy (TE) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-3 نشان داده شده است. اتصال هر سه ترکیب موثره glabridin, catechin, fisetin به پروتئین CLpro3 منجر به کاهش شدید میزان انرژی کل می شود که بیانگر تمایل اتصال و برهمکنش بین لیگاند و گیرنده است. تصویر شماره 3-4-3 : مقادیر مربوط به میزان انرژی کل Total Energy (TE). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان شعاع چرخشی Radius of gyration (Rg) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-4 نشان داده شده است. اتصال هر کدام از ترکیبات به پروتئین CLpro3 باعث ایجاد تغییراتی در میزان شعاع چرخشی آنزیم شده است. اتصال سه ترکیب موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین CLpro3 منجر به افزایش شدید میانگین شعاع چرخشی شده است. این افزایش در میانگین شعاع چرخشی پروتئین CLpro3 منجر به بروز تغییرات شدید در ساختار پروتئین CLpro3 می شود. تصویر شماره 3-4-4 : مقادیر مربوط به میزان شعاع چرخشی Radius of gyration (Rg). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin   مقادیر مربوط به میزان میانگین نوسانات آمینواسید های پروتئین (RMSF) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-5 نشان داده شده است. به نظر می رسد که هر سه ترکیب موثره Glabridin, Catechin, Fisetin اثر مشابهی در مهار نوسانات آمینواسیدهای پروتئین CLpro3 داشته باشند. بیشترین میزان کاهش نواسانات آمینواسیدی در محدوده توالی های آمینواسیدی 40 تا 50 اسید آمینه و همینطور محدوده توالی آمینواسیدی 180 تا 190 و 230 تا 270 آمینواسیدی است. کاهش نواسانات آمینواسیدی در اثر اتصال هر کدام از لیگاندها به پروتئین CLpro3 که در تصویر شماره 3-4-5 به رنگ قرمز نشان داده شده است می تواند نشاندهنده اثرات مهاری این ترکیبات بر پروتئین مورد مطالعه باشد. تصویر شماره 3-4-5 : مقادیر مربوط به میزان میانگین نواسانات آمینواسید های پروتئین (RMSF). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان میانگین پیوندهای هیدروژنی در ساختار پروتئین CLpro3در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-6 نشان داده شده است. اتصال هر کدام از لیگاندهای ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر به القاء نوساناتی در میزان و تعداد پیوندهای هیدروژنی در طول مدت زمان شبیه سازی شده است. این نوسانات در تعداد پیوند هیدروژنی در ساختار پروتئین بیانگر تاثیر گذار بودن ترکیبات موثره گیاهی (Glabridin, Catechin, Fisetin) بر پروتئین آنزیمی CLpro3 است. تصویر شماره 3-4-6: مقادیر مربوط به میزان میانگین پیوندهای هیدروژنی. نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin همچنین تغییراتی که ساختار دوم پروتئین CLpro3در اثر اتصال هر کدام از لیگاندهای مورد مطالعه در طول مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، اتفاق افتاده است در تصویر شماره 3-4-7 نشان داده شده است. . اتصال هر کدام از لیگاندهای ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر کاهش شدید در میانگین ساختار دوم آلفا هلیکس و ساختار دوم Bend شده است. همین طور اتصال این ترکیبات به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر افزایش در ساختارهای دوم بتا شیت و Turn شده است. این تغییرات در ساختار دوم پروتیئن در اثر اتصال لیگاند، نشاندهنده اثرگذاری این ترکیبات بر پروتئین هدف است. تصویر شماره 3-4-7: تغییرات القاء شده در ساختار دوم پروتئین CLpro3 در اثر اتصال ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin بحث و نتیجه گیری نتایج حاصل از این مطالعه شبیه سازی نشان می دهد که پس از اتصال ترکیبات موثره Catechin ، Fisetin ، Glabridin از نظر دینامیک مولکولی تاثیرات بسیار زیادی را بر پروتئین پروتئاز 3CLpro ویروس Covid-19 ایجاد می کند. سیستم های شبیه سازی شده در این مطالعه، از نظر میزان تغییرات RMSD بعد از زمان 30 نانوثانیه به پایداری رسیده اند به طوری که تغییرات RMSD نسبت به زمان از زمان 30 نانوثایه به بعد به حداقل رسیده است (تصویر شماره 3-4-2) اما ما شاهد یک کاهش شدید در میانگین RMSD در پروتئین داکت شده با Glabridin و یک افزایش جزئی در میانگین RMSD در پروتئین داکت شده با Catechin ، Fisetin هستیم. این تغییرات در میزان RMSD، نوسانات ساختاری پروتئین 3CLpro را تحت تاثیر قرار داده است. (تصویر شماره 3-4-2) مطالعات نشان داده اند که تغییرات در میزن RMSD می تواند ساختار پروتئین را تحت تاثیر قرار دهد(34). تمایل بالای اتصال هر سه ترکیب موثره Catechin ، Fisetin ، Glabridin به پروتئین پروتئاز 3CLpro موجب آزاد سازی انرژی و تسهیل برهمکنش بین لیگاند گیرنده شده است (تصویر شماره 3-4-3) این تمایل بالای اتصال موجب شده است که میزان شعاع چرخشی پروتئین شدیدا تحت تاثیر قرار گیرد. اتصال هر سه ترکیب مورد مطالعه مخصوصاً اتصال Galibridin به پروتئین منجر به افزایش در شعاع چرخشی پروتئین شده است. که نشان دهنده تغییرات شدیدی است که این ترکیبات بر ساختار فضایی پروتئین ایجاد کرده اند. (تصویر شماره 3-4-4) تغییر در شعاع چرخشی پروتئین ها همواره سطح در دسترس قرار گرفتن لیگاندها را محدود کرده و می تواند فعالیت آنزیمی پروتئین را تحت تاثیر قرار دهد(35). اثرات مهاری هرکدام از ترکیبات Catechin ، Fisetin ، Glabridin بر میزان نوسانات Amino acid residue های پروتئین پروتئاز که با استفاده از پارامتر RMSF مورد ارزیابی قرار گرفت (تصویر شماره 3-4-5) نشان می دهد که این ترکیبات می توانند Amino acid residue های 40 تا 50 و Amino acid residue های 180 تا 190 و همینطور Amino acid residue های 230 تا 270 را در پروتئین پروتئاز مهار کنند(36). اتصال هرکدام از ترکیبات Catechin ، Fisetin ، Glabridin تغییرات شدیدی را در ساختار دوم پروتئین ایجاد کرده است (تصویر شماره 3-4-7) این تغییرات شامل کاهش شدید در میزان ساختار ثانویه Coil و افزایش شدید در میزان ساختار ثانویه β-sheet است. از آنجا که مناطق Coil نواحی عملکردی پروتئین محسوب می شوند با کاهش در میزان این ساختارهای ثانویه میزان انعطاف پذیری پروتئین به شدت کاهش یافته و با افزایش نواحی β-sheet محدودیت شدیدی در انعطاف پذیری پروتئین ایجاد می شود که به نظر میرسد فعالیت این آنزیم را به شدت کاهش دهند. مطالعات گذشته نشان می دهد که ترکیبات موثره گیاهی نقش بسزایی در مهار فعالیت بسیاری از ویروس ها دارند. دلفینیدین ، یک رنگدانه گیاهی پلی فنولی است که به گل ها و انواع توت ها رنگ آبی-بنفش می بخشد ، به عنوان یک مهار کننده ورود در برابر همه ژنوتیپ های ویروس هپاتیت C گزارش شده است. نتایج یک مطالعه شبیه سازی شده نشان داد که دلفینیدین از طریق کاهش تمایل اتصال ویروس هپاتیت C به سطح سلول سبب کاهش بروز عفونت توسط این ویروس در سلول ها می گردد(20). سینامالدئید مشتق شده از روغن دارچین دارای بسیاری از اثرات دارویی و سمیت پایین است. مطالعات نشان داده اند که سینامالدئید رشد ویروس آنفلوانزا PR8را در رده سلولیMDCK به شیوه ای وابسته به غلظت بدون آسیب سلولی مهار می کند. همچنین در موش های آلوده به ویروس آنفلوانزا PR-8، استنشاق سینامالدئید (50 میلی گرم در قفس در روز) و تلقیح بینی (250 میکروگرم بر / موش / روز) به طور قابل توجهی میزان بقا را در 8 روز بعد از ایجاد عفونت نسبت به گروه کنترل افزایش میدهد(21). همچنین مطالعات نشان داده اند که گالیک اسید یکی از فراوان ترین اسیدهای فنلی در گیاهان (22) فعالیت ضد ویروسی قوی و گسترده ای را در برابر ویروس های آنفولانزایA و B نشان می دهد و منابع امیدوار کننده ای از عوامل موثر در برابر ذرات ویروس هستند(23). p-Cymene وCarvacrol مونوترپنهای معطر بوده و از از لحاظ ساختاری مرتبط با هم هستند که از روغنهای گونه های مختلف گیاهی به دست می آیند. کارواکرول به دلیل وجود یک گروه هیدروکسیل متصل به حلقه معطره و امکان تثبیت تشکیل رادیکالهای آزاد به یک کلاس از آنتی اکسیدان های طبیعیاست که از پراکسیداسیون لیپیدها جلوگیری می کند.سایمن ساختار مشابهیبا کارواکرول را دارد اما گروه هیدروکسیل در حلقه معطر وجود ندارد(24). مطالعات نشان داده اند که این ترکیبات فعالیتهای بیولوژیکی متفاوتی از جمله فعالیت های ضد توموری ، ضد باکتریایی ، ضد قارچ ، ضد التهابی و آنتی اکسیدان را دارا می باشند(25, 26). مطالعه نشان داده اند که، مونوترپن های تیمول، کارواکرول و سایمن علیه ویروس هرپس تایپ 1 در محیط invitro فعالیت ضدویروسی دارند. مطالعات نشان داد که اثر این ترکیبات بر روی ویروس احتمالا از طریق برهکنش با پوشش ویروس می باشد(27). غربالگری بر مبنای مطالعات In-silico از جمله سودمندترین روش ها برای شناسایی داروهای ضدویروسی جدید می باشد. غربالگری محاسباتی ترکیبات دارویی و گیاهان دارویی با استفاده از مطالعات داکینگ مولکولی، سبب صرفه جویی در زمان و هزینه و کاهش خطاهای احتمالی مربوط به کارآزمایی های بالینی می گردد(12) نتایج این مطالعه نشان می دهد که بسیاری از ترکیبات گیاهی با تمایل بالایی که برای اتصال و برهمکنش با پروتئین پروتئاز اصلی ویروس کرونا دارند می توانند اثرات مستقیمی بر ساختار این آنزیم القاء کنند. این برهمکنش ها منجر به تغییرات اساسی در ساختارهای دوم و سوم پروتئین می شود که می توانند اختلالاتی را در عملکرد این آنزیم ایجاد کنند. با توجه به نتایج این مطالعه و از آنجایی که سه ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin بیشترین تاثیر گذاری را بر ساختار و احتمالا فعالیت پروتئین آنزیمی 3CLpro دارند. Fisetin به طور عمده در اغلب سبزیجان و میوه ها مانند پیاز، سیب، و توت فرنگی وجود دارد(37). همین طور Catechin به عنوان یک ترکیب فنلی و آنتی اکسیدانی در گیاهانی مانند تیره باقالایان وجود دارد(38). Glabridin یک ایزوفلاونوئید است که در ریشه شیرین بیان به وفور یافت می شود(39). این مطالعه شبیه سازی شده پیش بینی می کند که این تغییرات القاء شده در ساختار آنزیم منجر به مهار فعالیت آن می شود. با توجه به این نتایج و برای اثبات این یافته ها لازم است که مطالعات آزمایشگاهی invitro و invivo به صورت تکمیلی انجام شود و نقش مهاری این ترکیبات شناخته شده مورد تایید قرار گیرد. و همین طور لازم است مطالعات تکمیلی بر روی این گیاهان که سرشار از ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin هستند انجام پذیرد تا تاثیر گذاری آنها را در مهار ویروس کرونا تایید نمایند.

خلاصه نتایج حاصله

نتایج مربوط به مطالعات داکینگ مولکولی و میزان انرژی آزاد سازی (Estimated Free Energy of binding) هنگام اتصال هر کدام از ترکیبات به جایگاه اتصال آنزیم CLpro3 در جدول شماره 3-4-1 نشان داده شده است. تعداد اسیدآمینه های موجود در جایگاه اتصال برای هرکدام از ترکیبات و نوع پیوند هیدروژنی یا پیوند هیدروفوب نشان داده شده است. از بین تمام ترکیبات مورد مطالعه به نظر می رسد که Catechin با 8.12 kcal/mol و Glabridin با 8.25 kcal/mol و Fisetin با 8.11 kcal/mol تمایل بسیار بالاتری نسبت به سایر ترکیبات برای اتصال با پروتئین CLpro3 دارند. این میزان انرژی آزاد شده در اثر اتصال این ترکیبات با پروتئین CLpro3 بسیار نزدیک با میزان انرژی آزاد شده در اثر اتصال مهار کننده Nelfinavir با 9.68 kcal/mol به پروتئین CLpro3 است. جدول شماره 3-4-1. نتایج داکینگ مولکولی Interaction bonds EIC µM FIE kcal/mol BE kcal/mol Ligand- receptor hydrophobic interactions Hydrogen Bonding Arg188, Gln189, His164, His41, Met165 Glu166 180.80 -5.70 -5.11 Carvacrol His164, Met165, Pro168, Thr190, Gln189, Arg188, His41, Gln192, Glu166, Tyr57, Asp187 1.13 -9.90 -8.12 Catechin His41, Asp187, Tyr54, Arg188, His164, Gln189, Met165 Glu166 454.11 -5.16 -4.56 Cinnamaldehyde Asn63, His64, Phe66, Gln74, Leu75, Leu67, Arg76 Val68, Val77, 139.43 -5.26 -5.26 Coumarin His41, Cys145, Met165, His164, Thr190, Ala191, Pro168, Gln189, Arg188 Asp187, Tyr54, Glu166, Gln192 1.64 -9.68 -7.89 Cyanidin Arg188, Gln189, Ala191, Thr190, Pro168, His164, Met165, His41 Tyr54, Asp187, Glu166, Gln192 2.31 -9.78 -7.69 Delphinidin Gln189, Thr190, Pro168, Ala191, Leu167, His41, Met165, Arg188, His164 Tyr54, Asp187, Gln192, Glu166 1.14 -9.60 -8.11 Fisetin Cys145, His164, Met165, Ala191, Leu167, Pro168, Glu166, Arg188, Gln189 His41, Gln192, Thr190 10.36 -7.99 -6.80 Genistein Thr26, Leu27, Cys145, His164, His41, Glu139, Met165, Leu141, Asn142 Glu166, Arg188, Gly143 0.90 -9.14 -8.25 Glabridin His164, Arg188, Gln189, Pro168, Ala191, Thr190, Leu167, Met165, His41, Tyr54, Gln192, Glu166, Asp187 2.63 -9.40 -7.61 Isorhamnetin Arg188, Gln189, Thr190, Ala191, Leu167, Pro168, Glu166, Met165, Asp187, His41, His164 Tyr54, Gln192, 2.77 -8.48 -7.58 Liquiritigenin Ala191, Arg188, His41, Met49, His164, Cys145, Met165, Asn142, His163, Ser144, Leu141, Gly170, Leu167, Pro168 Gln192, Thr190, Gln189, Glu166 0.08 -13.26 -9.68 Nelfinavir Arg217, Thr257, Ile213, Val303, Gln256, Thr304, Gln306, Phe305, Val212 ------------ 306.35 -5.09 -4.79 p-cymene Pro52, Tyr54, Met49, Cys44, His164, His41, Cys145, Met165, Asn142, Phe140, His163, Glu166, Ser144, Leu141, Arg188, Gln189, Asp187, Gly143 1.65 -8.78 -7.89 Piperine Glu166, Ser144, Cys145, Asn142, His41, Asp187, Met49, Gln189, Arg188, Met165, His164, Leu141, Phe140, Gly143, His167 2.60 -9.11 -7.62 Pterostilbene Gln189, Met165, Arg188, Pro168, Thr190, Ala191, Cys145, His164, His41 Glu166, Asp187, Tyr54 2.91 -10.24 -7.55 Silibinin Phe3, Arg4, Leu282, Glu288, Phe291 Lys5, Trp207 94.45 -5.79 -5.49 Thymoquinone Abbreviations: BE; Estimated Free Energy of binding (kcal/mol), EIC; estimated inhibition constant (μM). شکل شماره 3-4-1 محل اتصال هر کدام از ترکیبات موثره Catechin، Glabridin، و Fisetin را در محل اتصال پروتئین CLpro3 و همین طور جایگاه اتصال مهار کننده Nelfinavir را در محل اتصال با پروتئین CLpro3 نشان می دهد. هر سه ترکیب Catechin، Glabridin، و Fisetin تقریبا در جایگاه مشابهی با مهار کننده Nelfinavir در محل اتصال با پروتئین CLpro3 متصل می شوند. شکل شماره 3-4-1: محل اتصال هر کدام از ترکیبات موثره Catechin، Glabridin، و Fisetin در مقایسه با محل اتصال مهار کننده Nelfinavir در جایگاه اتصال پروتئین CLpro3. (A) Nelfinavir inhibitor, (B) glabridin, (C) catechin and (D) fisetin مقادیر مربوط به میزان root-mean-square deviation (RMSD) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-2 نشان داده شده است. هر چند که در پایان زمان شبیه سازی همه ترکیبات شامل پروتئین و پروتئین متصل به لیگاند به پایداری رسیده اند اما در طول زمان شبیه سازی شاهد یکسری نوسانات هستیم. این نتایج نشان می دهد که اتصال Catechin به پروتئین CLpro3 باعث کاهش در میزان RMSD مخصوصا در پایان زمان شبیه سازی می شود. اما در عین حال اتصال Glabridin به پروتئین CLpro3 باعث افزایش در میزان RMSD مخصوصا در پایان زمان شبیه سازی می شود. به نظر می رسد که اتصال Fisetin به پروتئین CLpro3 باعث ایجاد تغییری در میزان میانگین RMSD در طول مدت زمان شبیه سازی نمی شود. تصویر شماره 3-4-2 : مقادیر مربوط به میزان root-mean-square deviation (RMSD). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان انرژی کل Total Energy (TE) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-3 نشان داده شده است. اتصال هر سه ترکیب موثره glabridin, catechin, fisetin به پروتئین CLpro3 منجر به کاهش شدید میزان انرژی کل می شود که بیانگر تمایل اتصال و برهمکنش بین لیگاند و گیرنده است. تصویر شماره 3-4-3 : مقادیر مربوط به میزان انرژی کل Total Energy (TE). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان شعاع چرخشی Radius of gyration (Rg) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-4 نشان داده شده است. اتصال هر کدام از ترکیبات به پروتئین CLpro3 باعث ایجاد تغییراتی در میزان شعاع چرخشی آنزیم شده است. اتصال سه ترکیب موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین CLpro3 منجر به افزایش شدید میانگین شعاع چرخشی شده است. این افزایش در میانگین شعاع چرخشی پروتئین CLpro3 منجر به بروز تغییرات شدید در ساختار پروتئین CLpro3 می شود. تصویر شماره 3-4-4 : مقادیر مربوط به میزان شعاع چرخشی Radius of gyration (Rg). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin   مقادیر مربوط به میزان میانگین نوسانات آمینواسید های پروتئین (RMSF) در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-5 نشان داده شده است. به نظر می رسد که هر سه ترکیب موثره Glabridin, Catechin, Fisetin اثر مشابهی در مهار نوسانات آمینواسیدهای پروتئین CLpro3 داشته باشند. بیشترین میزان کاهش نواسانات آمینواسیدی در محدوده توالی های آمینواسیدی 40 تا 50 اسید آمینه و همینطور محدوده توالی آمینواسیدی 180 تا 190 و 230 تا 270 آمینواسیدی است. کاهش نواسانات آمینواسیدی در اثر اتصال هر کدام از لیگاندها به پروتئین CLpro3 که در تصویر شماره 3-4-5 به رنگ قرمز نشان داده شده است می تواند نشاندهنده اثرات مهاری این ترکیبات بر پروتئین مورد مطالعه باشد. تصویر شماره 3-4-5 : مقادیر مربوط به میزان میانگین نواسانات آمینواسید های پروتئین (RMSF). نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin مقادیر مربوط به میزان میانگین پیوندهای هیدروژنی در ساختار پروتئین CLpro3در مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، در تصویر شماره 3-4-6 نشان داده شده است. اتصال هر کدام از لیگاندهای ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر به القاء نوساناتی در میزان و تعداد پیوندهای هیدروژنی در طول مدت زمان شبیه سازی شده است. این نوسانات در تعداد پیوند هیدروژنی در ساختار پروتئین بیانگر تاثیر گذار بودن ترکیبات موثره گیاهی (Glabridin, Catechin, Fisetin) بر پروتئین آنزیمی CLpro3 است. تصویر شماره 3-4-6: مقادیر مربوط به میزان میانگین پیوندهای هیدروژنی. نمودار سیاه رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و نمودار قرمز رنگ: شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک است. a) Catechin ، b) Fisetin و c) Glabridin همچنین تغییراتی که ساختار دوم پروتئین CLpro3در اثر اتصال هر کدام از لیگاندهای مورد مطالعه در طول مدت زمان 50 نانوثانیه از فرایند شبیه سازی دینامیک مولکولی قبل از داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی بعد از داکینک مولکولی، اتفاق افتاده است در تصویر شماره 3-4-7 نشان داده شده است. . اتصال هر کدام از لیگاندهای ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر کاهش شدید در میانگین ساختار دوم آلفا هلیکس و ساختار دوم Bend شده است. همین طور اتصال این ترکیبات به پروتئین آنزیمی CLpro3 منجر افزایش در ساختارهای دوم بتا شیت و Turn شده است. این تغییرات در ساختار دوم پروتیئن در اثر اتصال لیگاند، نشاندهنده اثرگذاری این ترکیبات بر پروتئین هدف است. تصویر شماره 3-4-7: تغییرات القاء شده در ساختار دوم پروتئین CLpro3 در اثر اتصال ترکیبات موثره Glabridin, Catechin, Fisetin

فایل های پژوهش