پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله 2زمینه و سا بقه درحال حاضر سرطانها به عنوان یک مشکل بهداشتی جدی در جهان مطرح هستند و سالانه میلیونها بیمار سرطانی جدید تشخیص داده می شوند که بسیاری از این موارد به مرگ منجر می گردد. سرطان در کشورهای صنعتی نسبت به کشورهای در حال رشد رواج بیشتری دارد. به دلیل تغییر شرایط زندگی و نوع عوامل خطر، شیوع انواع سرطان نیز متفاوت است(.)1 1-1سرطان معده تومورهای بدخیم بافت های اپی تلیال، معمول ترین نوع سرطان هستند که اکثریت مرگ و میر ناشی از سرطان را شامل می شوند( .)2سرطان معده نیز یکی از سرطان های اپی تلیالی است که در دنیای امروز شایع است(.)3 اگرچه با بهبود روش های زندگی در طی دهه های اخیر شیوع سرطان معده کاهش یافته است اما هنوز هم سرطان معده دومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در سرتاسر دنیاست( .)4میزان مرگ و میر ناشی از سرطان معده در جهان 75000مورد است( .)5در ایران حدود 39درصد تمامی مرگ و میرهای ناشی از سرطان را سرطان معده تشکیل می دهد( . )6سالانه از هر 10000ایرانی 25نفر به سرطان معده مبتلا می شوند(.)7 2-1تشخیص ودرمان آدنوکارسینوم معده هیچ علامت منحصر به فردی که به عنوان مارکر سرطان معده شناخته شده باشد وجود ندارد. مطالعه ای که در ژاپن انجام شده است نشان می دهد که برنامه غربالگری برای سرطان معده ارزش محدوددارد. به همین دلیل هیچ توصیه ای برای غربالگری سرطان معده وجود ندارد(.)8 3-1درمان های معمول در حال حاضر اقدامات درمانی برای بیماران دارای سرطان معده اساسا شامل جراحی، شیمی درمانی و رادیوتراپی می باشد. خارج کردن کل تومور به کمک جراحی همراه با گره های لنفی مجاور، تنها بخت بیمار برای درمان است. با این حال، این روش در کمتر از یک سوم بیماران قابل اجرا است( .)9اثرات درمانی داروهای شیمی درمانی به اندازه کافی مناسب نبوده و این داروها به میزان زیادی دارای اثرات جانبی هستند( .)10بنابراین در سالهای اخیر تمرکز زیادی بر روی تحقیقات در مورد داروهائی شده است که بتوانند اثر محافظت کننده یا درمانی بر روی سرطان معده و سایر سرطانها داشته باشند(.)118 4-1سرطان پروستات در میان انواع سرطانها شیوع بسیار بالای سرطان پروستات()15-12توجه ویژه بسیاری از محققین را به خود جلب کرده است ،به طوری که ششمین رتبه در میان سرطانهای شناخته شده در جهان را به خود اختصاص داده است( .)14سرطان پروستات بیماری است که طی ان سلولهای بافتهای مختلف غده پروستات سرطانی میشوند و به طور عمده در مردان مسن دیده میشوند( .)16سرطان پروستات دومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در مردان است،به طوریکه 25درصد مردان جهان از این سرطان میمیرند، بعلاوه بیماران مبتلا به سرطان پروستات برای بهبود علایمی مانند درد،خون ریزی و انسداد مجاری ادراری به مصرف دارو نیاز دارند. بنابر این سرطان پروستات از علل عمده درد و رنج و ایجاد هزینه مراقبتهای بهداشتی نیز هست( .)17گرایش عمومی جامعه به استفاده از داروها و درمان های گیاهی و به طور کلی فرآورده های طبیعی به ویژه در طی سال های اخیر رو به افزایش بوده و مهمترین علل آن اثبات اثرات مخرب و جانبی داروهای شیمیایی از یک طرف و ایجاد آلودگی های زیست محیطی که کره زمین را تهدید می کند از سوی دیگر بوده است. طبق آمار سازمان بهداشت جهانی بالغ بر % 80مردم جهان به ویژه در کشورهای در حال توسعه و نواحی فقیر و دور افتاده عمده ترین نیازهای درمانی خود را از گیاهان دارویی تأمین می کنند. از سوی دیگر گیاهان دارویی جزء ذخایر و منابع طبیعی هستند و بسیاری از کشورها کم یا زیاد از یک چنین منبعی برخوردارند که نوع، تعداد و تنوع گونه های گیاهی براساس شرایط و موقعیت جغرافیایی هر منطقه متفاوت است(.)18 از آنجا که بسیاری از داروهای شیمیایی باعث اختلالات گوارشی، آسیب های کلیوی و ... می شوند، دانشمندان به دنبال یافتن داروهایی هستند که عوارض جانبی کمتری نسبت به داروهای شیمیایی داشته باشند، در این راستا گیاهان دارویی مورد توجه بسیار قرار گرفته اند. گیاهان دارویی به علت همراه داشتن ترکیبات دیگری همراه با ترکیب با اثر دارویی خاص از عوارض جانبی کمتری نسبت به داروهای شیمیایی برخوردارند (.)19 -2مفاهیم امروزه استراتژی امیدوار کننده برای جلوگیری از سرطان، داروهایی هستند که به طور صناعی یا طبیعی گسترش سرطان را متوقف میکنند. اکنون پذیرفته شده که گیاهان و نیز داروهای سنتی منبع اصلی جلوگیری از سرطان هستند( .)20با توجه به تشخیص دیررس،پیچیدگی روشهای درمانی و پیشگیری از سرطان و غالب شدن جمعیت سلولهای سرطانی مقاوم به ترکیبات شیمی درمانی متداول لزوم استفاده از داروهای گیاهی مطرح و تایید شده است. دم اسب یکی از این گیاهان است که جهت درمان بیماری های مختلف مورد استفاده قرار میگیرد. Equistum arvenseدر فارسی به دم اسب معروف است،این گیاه درسراسر اروپا پراکندگی داردو در9 ایران در نواحی شمالی و کردستان و اذربایجان میروید( .)21ترکیبات شیمیایی این گیاه شامل: سیلیسیک، اکسالیک، مالیک، الکالوئید، گلوکوزید، اکونیتیک و املاح پتاسیم والومینیوم و نوعی ساپونین بنام اکوئی ستین است( .)22گیاه دم اسب از گیاهانی است که در کشور ما به وفور یافت میشود و دارای اثرات مختلف ضد سرطان سینه، دیابتی، میکروبی ، التهابی ، التیام زخم های سطحی و... می باشد.با توجه به اثرات ضد سرطانی(سرطان سینه) دم اسب درمطالعات قبلی این مطالعه با هدف بررسی اثرات عصاره هیدرو الکلی دم اسب و فرکشنهای ان بر میزان پرولیفریشن و همچنین القا اپوپتوز در سلولهای سرطان معده ( ) AGSو سرطان پروستات ( )PC3و مقایسه ان با سلول های سالم انسانی ( )HDFsدر محیط ازمایشگاهی ()In vitro انجام شد. روش اجرا ویکرد 1-3جمع آوری و تهیه عصاره تام گیاه در این پژوهش تجربی ، برگ گیاه دم اسب از عطاری خریداری شد و نام علمی آن در بخش هرباریوم مرکز تحقیقات گیاهان دارویی مورد تایید قرارگرفت. سپس نمونه های تهیه شده به وسیله آسیاب برقی خرد شدند. عصاره اتانولی با روش ماسیراسیون تهیه گردید. در این روش از اتانول 80درصد به عنوان حلال استفاده شده و سپس عصاره استخراج شده را با کاغذ صافی فیلتر نموده و تحت فشار نزدیک به خلاء و دمای 40درجه سلیوس توسط دستگاه روتاری ) (Rotary evaporatorتبخیر نمودیم تا تغلیظ شد. 2-3تهیه فراکسیونهای مختلف گیاهی پس از تهیه عصاره تام گیاهی ، از طریق روش پارتیشنینگ حلال در حلال، و با بهره گیری از تفاوت در قطبیت متابولیتهای ثانویه مختلف، فراکسیونهای مختلفی از عصاره تام که پلاریته آنها با یکدیگر متفاوت است تهیه شد. در این روش عصاره تغلیظ شده گیاه مجددا در متانول70درصددرحداقل میزان مورد نیاز حل شدو بدان به نسبت مساوی هگزان اضافه و پس از همزدن کافی فاز هگزانی آن جدا و بعنوان فراکسیون هگزانی تغلیظ و جهت آزمایشات بعدی نگهداری گردید. سپس با قیمانده متانولی آن تازمان خارج شدن متانول موجود در آن تغلیظ شد. باقیمانده در آب مقطر مخلوط شد، کلروفرم به نسبت مساوی بدان اضافه و پس از همزدن کافی فاز کلروفرمی با دوبار تکرار جدا و پس از تغلیط در فشار نزدیک به خلاء و دمای 40درجه سلیوس بعنوان فراکسیون کلروفرمی نگهداری گردید. به باقیمانده آبکی، به نسبت مساوی اتیل استات اضافه و فاز اتیل استاتی جدا شدو پس از تغلیظ بعنوان فراکسیون اتیل استاتی تهیه شد. به باقی مانده آبکی بوتانول اضافه و پس از10 همزدن کافی فاز بوتانولی با دو بار تکرار جدا و پس از تغلیط در فشار نزدیک به خلاء و دمای 40درجه سلیوس بعنوان فراکسیون بوتانولی مورد استفاده قرار گرفت. فاز آبکی باقیمانده نیز پس از تغلیط در فشار نزدیک به خلاء و دمای 40درجه سلیوس بعنوان فراکسیون آبکی جدا شد(.)23 3-3تعیین میزان آنتی اکسیدانی فراکشن ها در این مطالعه برای مقایسه اثر آنتی اکسیدان گیاهان و ترکیبات گیاهی از روش سنجش مهار رادیکال های آزاد یا )2,2-diphenyl-1-picrylhydracyl) DPPHاستفاده می شود. نمونه ها با غلظتهای متفاوت با یک میلی لیتر از محلول 90میکرومولار DPPHمخلوط و به وسیله ی متانول %95به حجم 4میلی لیتر رسید و برای مدت زمان 60دقیقه در تاریکی تکان داده شد. جذب محلولهای بدست آمده و شاهد (حاوی مواد شیمیایی یکسان، بجز نمونه) بعد از این مدت زمان، در طول موج 517نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده و درصد RSCبوسیله فرمول زیر محاسبه گردید: RSC (%) = 100 × (A blank –A sample/A blank) در این فرمول، A sampleو A blankبه ترتیب میزان جذب شاهد و نمونه می باشند. فعالیت آنتی اکسیدانی به صورت IC50بیان گردید و نشان دهنده غلظتی از ترکیب است که باعث %50بازدارندگی در ظرفیت رادیکالی می گردد . این مقدار ، به وسیله آنالیز همبستگی برای غلظت های مختلف نمونه ، RSCخطی حاصل از مقادیر تعیین شد. نتایج بدست آمده با مقدار IC50آنتی اکسیدان بوتیل هیدروکسی تولوئن ( )BHTبه عنوان کنترل مثبت مقایسه گردید(.)24 4-3چگونگی تعیین میزان فنول تام میزان ترکیبات فنولی کل بر اساس روش رنگ سنجی فولین سیوکالتیو و بر حسب اسید گالیک اندازه گیری می شود. محلولهای استاندارد با غلظت های 100 ،62/5 ،50 ،25 ،12/5و 125پی پی ام از اسید گالیک در محلول %60متانول تهیه گردیده و آنگاه از هریک 0/1میلی لیتر به لوله آزمایش منتقل شده و به آنها 0/5میلی لیتر از محلول %10واکنشگر فولین – سیوکالتو اضافه و پس از 3-8دقیقه 0/4میلی لیتر از محلول کربنات سدیم %7/5 اضافه می شود. به دنبال آن، لوله ها به مدت 30دقیقه در دمای آزمایشگاه نگهداری و پس از آن میزان جذب نوری بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 765نانومتر اندازه گیری شده و بر این اساس نمودار استاندارد رسم گردید. سپس 0/01تا 0/02گرم از نمونه خشک شده از عصاره در متانول %60حل شده و به حجم 10میلی لیتر رسانده و بر اساس روش فولین سیو کالتو میزان فنل کل تعیین گردیده، با این تفاوت که به11 جای محلول استاندارد 0/1میلی لیتر از محلول عصاره اضافه شد. در مرحله آخر، میزان جذب قرائت شده را در نمودار استاندارد قرار داده و به این ترتیب مقدار فنول کل عصاره بر حسب میلی گرم بر گرم اسید گالیک بدست امد(.)25 5-3چگونگی تعیین میزان فلاونوئید میزان فلاونوئید کل به روش رنگ سنجی کلرید آلومنیوم و بر حسب استاندارد روتین اندازه گیری گردید. در این روش، ابتدا محلولهای 100 ،50 ،25و 250و 500پی پی ام از روتین در متانول %60تهیه و 1میلی لیتر از این محلول ها به لوله آزمایش منتقل شد و آنگاه 1میلی لیتر از محلول کلرید آلومنیوم %2به آن اضافه گردید. سپس 6میلی لیتر از محلول %5استات پتاسیم به آن افزوده. میزان جذب نوری پس از 40دقیقه در طول موج 415نانومتر قرائت و بر این اساس نمودار استاندارد رسم شد. سپس 0/01تا 0/02گرم از نمونه خشک شده از عصاره و فرکشنهای ان را در متانول %60حل نموده و به حجم 10میلی لیتر رسانده شد و بر اساس روش رنگ سنجی کلرید آلومنیوم میزان فلاونوئید کل انها بر حسب میلی گرم روتین بر گرم تعیین گردید. تمامی آزمایشها 3بار تکرار و مقادیر متوسط حاصل از 3بار تکرار با استفاده از میانگین و انحراف معیار محاسبه و اقدام شد(.)26 6-3سلول های مورد استفاده سلول های AGSو pc3از بانک سلولی انیسیتو پاستور ایران خریداری و سلول سالم انسانی ( )HDFsاز مرکز تحقیقات سلولی و ملکولی دانشگاه تهیه شد. سلول ها در محیط کشت RPMIو DMEMحاوی 10درصد سرم ( )FBSکشت داده و استوک سلولی مورد نیاز تهیه گردید. 7-3بررسی مهار پرولیفریشن سلولی با روش MTT پس از شمارش، رده های سلولی مورد نظر داخل پلیت 96خانه کشت داده شد به طوری که در داخل هرحفره 5000سلول به همراه 100میکرولیتر محیط کشت، قرار داده شد. بعد از 24ساعت سلول ها با غلظت های مختلف عصاره و فرکشن های مختلف گیاه در زمان های 48 ،24و 72ساعت انکوبه شدند. MTTدر غلظت 5میلی گرم در میلی لیتر در محیط RPMIبدون سرم تهیه شد. پس از انکوباسیون سلول ها به همراه عصاره در زمان موردنظر، محیط رویی سلول ها خارج و هر حفره با 100میکرولیتر PBSبدون سرم شستشو داده شد و سپس MTTبه نسبت 1:5با PBSرقیق و به هر حفره 60میکرولیتر اضافه و به مدت 4ساعت در دمای12 37سانتی گراد انکوبه شد. پس از سپری شدن زمان انکوباسیون، محتویات حفره ها به آرامی خارج و به آنها 100 میکرولیتر DMSOاضافه شد و پس از 10دقیقه جذب نوری پلیت ها در 490نانومتر اندازه گیری گردید. میزان تکثیر سلول با مقایسه جذب چاهک های مختلف و کنترل بررسی و میزان IC50به کمک نرم افزار SPSSتعیین گردید. 8-3بررسی آپوپتوز با فلوسیتومتری سلول ها در پلیت های 6خانه ای کشت و پس از 24ساعت با غلظت یک IC50عصاره و فرکشن ها به مدت 48ساعت انکوبه شدو مطابق با دستور العمل کیت آپوپتوز و به کمک فلوسایتو متری نتایج بررسی گردید. بدین منظور سلول ها را از کف پلیت ها جدا کرده و 2بار با بافر کلسیم شستشو داده، سپس 10میکرولیتر از Annexin Vرا با 100میکرولیتر سلول مخلوط کردیم، 20دقیقه در تاریکی و روی یخ انکوبه کرده، سپس سلول ها را شسته و 10میکرولیتر رنگ پروپیدیوم ایوداید ) (PIبه آن اضافه و 10دقیقه در تاریکی روی یخ انکوبه کرده و نمونه ها با فلوسیتومتری آنالیز شدند. در این روش سلول هایی که دچار آپوپتوز اولیه شدند فقط رنگ Annexin Vرا گرفته و سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شدند و دیواره سلولی آنها اندکی نفوذ پذیر شد با دو رنگ Annexin Vو رنگ PIرنگ شدندو سلول هایی که دچار نکروز شدند فقط رنگ PIرا به خودگرفتند و هر کدام در Plotفلوسیتومتری جداگانه قرار داده شدند. -4یافته ها یافته ها در این مطالعه تاثیر عصاره تام و فرکشن های مختلف برگ گیاه دم اسب بر میزان پرولیفریشن و آپوپتوزیس بر روی یک رده سلولی از ادنوکارسینوما معده به نام AGSو یک رده سلولی از پروستات کانسر به نام pc3مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا لازم بود اثرات مهاری رشد (ضد پرولیفراسیون) یا سمیت (توکسیسیتی) هر کدام از عصاره و فرکشن ها مشخص شود، که از تست MTTبه این منظور استفاده شد. در مرحله بعد مکانیسم اثرات عصاره تام و فرکشن های ان به لحاظ القای آپوپتوز بررسی گردید. در هر مورداز کیت به همراه بررسی نتایج به روش فلوسیتومتری استفاده گردید. نهایتا اثرات عصاره تام و فرکشن های ان به روش MTTو با بهره گیری از نرم افزار ) SPSS(20مورد مطالعه قرار گرفت.13 1-4خواص فیتوشیمیایی عصاره تام و فرکشن های مختلف برگ گیاه دم اسب در این مطالعه ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره تام برگ دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان به روش DPPH انجام گرفت و باهم مقایسه شد، در این بین فراکشن اتیل استات با ( IC50غلضت مهار رادیکال آزاد 50 درصد) 5/25±0/75میکروگرم/ میلی لیتر دارای بیشترین و فراکشن ان هگزانی با 834/1±8/6 IC50میکروگرم/ میلی لیتر داری کمترین ظرفیت آنتی اکسیدانی است(جدول شماره .)1همچنین میزان فنول تام با روش فولین سیوکالتیو برحسب منحنی استاندارد گالیک اسید اندازه گیری و محاسبه شد که فرکشن اتیل استات با فنول 509میلی گرم گالیک اسید به گرم عصاره دارای بیشترین و ان هگزان با فنول 24/6میلی گرم گالیک اسید به گرم عصاره دارای کمترین میزان فنول تام بودند.از لحاظ آماری، ارتباط معنی داری ( )P<0/05بین فعالیت انتی اکسیدانی و محتوی فنولی عصاره و فرکشن ها مشاهده گردید.بر اساس نتایج این مطالعه میتوان اذعان داشت فرکشن اتیل استاتی گیاه دم اسب از ترکیبات فنولی بیشتری برخوردار است و هم چنین ظرفیت تام انتی اکسیدانی بالاتری دارد.با توجه به اینکه ترکیبات فنولی جز ترکیبات قطبی میباشند ،در فرکشن های قطبی نیز استخراج و رویت شدند. در ضمن بر اساس یافته های حاصل از اندازه گیری فلاونوئید که به روش کلرید آلومینیوم اندازه گیری و بر اساس منحنی استاندارد روتین محاسبه شد، فرکشن کلروفرمی با 123/4و فراکشن ان هگزان با 21/8میلی گرم روتین بر گرم عصاره به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان فلاونوئید هستند(جدول شماره.)214 جدول:1ظرفیت انتی اکسیدانی عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان به DPPH روش Sample Concentration (μg/ml ) Scavenging of DPPH radical activity inhibition (%) (main ± SEM) DPPH-radical scavenging activity IC50 / (μg/ml ) عصاره تام دم اسب 125 94/8±1/8 22/7±2/4 62/5 89/5±2/2 31/25 53/7±2/6 15/62 31/4±3.2 7/8 16/7±9.1 3/9 8 فرکشن ان-هگزان 1000 62/9±2/4 834/1±8/6 500 29/5±1/3 250 7/7±1/24 125 6/2±0/85 62/5 4±0/4 فرکشن کلروفرم 175 72/5±2/63 92/9±5/7 87/5 40/1±1/45 43/75 29/5±2/1 21/9 18/7±1/69 10/9 7/4±0/47 فرکشن اتیل استات 100 93/9±2/36 5/25±0/75 50 94/4±1/49 25 90/1±0/87 12/5 88/7±2/38 6/25 53/15±2/55 فرکشن ان-بوتانول 100 95/3±1/78 18/43±2/38 50 77/7±2/63 25 25/9±3/25 12/5 30/85±2/5 6/25 22/3±1/3415 بوتیل هیدروکسی تولوئن 200 90/2±1/2 33/5±3/67 100 78/2±3/5 50 55/6±0/99 25 37±2/35 12/5 22/9±1/63 6/25 15/2±2 3/125 12/3±1/76 جدول شماره :2خواص فیتو شیمیایی فنول و فلاونوئید عصاره هیدروالکی برگ گیاه دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان فنول تام نمونه )میلی گرم گالیک اسید بر گرم عصاره( فلاونوئید )میلی گرم روتین بر گرم عصاره( 140/8 50/5عصاره تام دم اسب 24/6 21/8فرکشن ان-هگزان 42 123/4فرکشن کلروفرم 509 79/2فرکشن اتیل استات 169/2 31/7فرکشن ان-بوتانول16 2-4تاثیرمهاررشدی عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب بر روی سلولهای pc3 ،AGSوHDFs به منظور بررسی فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب در رده های سلولی AGSو pc3 (سرطانی)و ( HDFsطبیعی) ابتدا پس از شمارش، رده های سلولی مورد نظر داخل پلیت 96خانه کشت داده شد، به طوری که در داخل هر حفره 5000سلول به همراه 100میکرولیتر محیط کشت، قرار داده شد. بعد از 24 ساعت سلول ها با غلظت های مختلف عصاره گیاه در زمان های 48 ،24و 72ساعت انکوبه شدند و زیستایی سلول ها با روش MTTاندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که زیستایی سلول به صورت قابل توجهی وابسته به زمان و هم چنین کاهش دوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب است (شکل .)1بر اساس مدل رگرسیون پروبیت، فعالیت ضد تکثیری عصاره تام در 3رده سلولی مورد مطالعه تفاوت چشمگیری ( )P>0/001داشتند (شکل .)1 3-4اثرمهار رشدی فرکشنهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب بر روی سلولهای HDFs وpc3 ،AGS پس از تهیه عصاره تام گیاهی ، عصاره تغلیظ شده گیاه مجددا در متانول 70درصد حل شد و سپس از طریق روش پارتیشنینگ حلال در حلال، و با بهره گیری از تفاوت در قطبیت متابولیتهای ثانویه مختلف، فراکسیونهای مختلفی از عصاره تام که پلاریته آنها با یکدیگر متفاوت است تهیه گردید، سپس سلول ها با غلظت های مختلف فراکسیون های ان-بوتانولی ، کلروفرمی،ان-هگزانی و اتیل استاتی به مدت72و48و 24ساعت تیمار شدند و با استفاده از روش MTTمورد بررسی قرار گرفتند، نتایج میانگین ± انحراف معیار .n=3انالیزداده ها با استفاده از مدل رگرسیون پروبیت نشان دهنده تفاوت معنا دار، فعالیت ضد تکثیری فراکسیون های مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بین رده های سلولی سرطانی( PC3و ) AGSوغیرسرطانی( )HDFsبود ( .)P>0/05زیستایی سلول در هر 2رده سلولی سرطانی تیمار شده با فراکسیون های مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام دم اسب وابسته به کاهش دوز و زمان تیمار بود و اثر مهار تکثیری فراکسیون ها بعد از تیمار رده های سلولی در زمان های مختلف مشاهده شد، در رده سلولی PC3فرکشن ان-هگزانی با وجود کمترین میزان انتی اکسیدانی و خواص فنولی،پایین ترین میزان IC50را در بین سایر فرکشن ها و عصاره تام داشت که احتمالا به دلیل سمیت این فرکشن بر روی این رده و پیشبرد سلول ها به سمت نکروز می باشد (نتایج فلوسیتومتری هم موید این نظریه می باشد و میزان اپوپتوز این فرکشن بر روی این رده سلولی هم پایین بود)(شکل 3و.)217 بر اساس مدل رگرسیون پروبیت،فعالیت ضد تکثیری فراکسیون ها در هر 3رده سلولی مورد مطالعه به صورت قابل ملاحضه ای متفاوت بودند( .)P>0/01پس از انجام تست های اولیه بر اساس سرعت رشد رده های سلولی 48ساعت به عنوان بهترین زمان برای بررسی اثرات توکسیسیتی عصاره تام و فرکشن های ان انتخاب شدو میزان IC50های اندازه گیری شده با 48ساعت انکوباسیون، عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان برروی رده های سلولی AGSو PC3کمتر از رده سلولی HDFsبودند (جدول شماره.) 3 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 viability% concentrationµg/ml AGS 48 24 72 Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h شکل :1مقایسه تاثیر غلظت عصاره هیدروالکلی تام دم اسب بر میزان بقا سلولی در زمان های مختلف ،24 48و 72ساعت تیمار سلولها بر 2رده سلولی سرطانی(AGSو )PC3و رده نرمال سلولی : HDFsیافته ها نشان دهنده تاثیر مهارکنندگی عصاره بر رشد سلولی وابسته به زمان است و همچنین فعالیت ضد تکثیری عصاره تام در 3رده سلولی مورد مطالعه تفاوت چشمگیری()P>0/001داشت. رده سلولی PC318 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 48h 24h 72h شکل :2اثار مهار رشد فراکسیونهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر رده سلول های سرطانی AGSدر زمان های مختلف تیمار.19 Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h شکل:3اثار مهار رشد فراکسیونهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر رده سلول های سرطانی PC3در زمان های مختلف تیمار. اتیل استاتی ان-هگزانی ان-بوتانولی کلروفرمی20 جدول :3میزان IC50عصاره تام هیدروالکلی برگ دم اسب وفراکسیونهای مشتق شده ازان در 3رده سلولی مورد مطالعه. رده سلولی فرکشن/عصاره HDFs (μg/ml) AGS (μg/ml) PC3(μg/ml) فاصله اطمینان IC50 %55فاصله اطمینان IC50 %55فاصله اطمینان IC50 %55 عصاره تام دم اسب554/2 562/6-1225/7 6773 62/2-75/2 155/1 132-186/5 فرکشن ان-هگزانی743/4 558/7-547/1 51/8 28/5-72/3 87/4 72/5-124/4 > فرکشن کلروفرمی1222 853/1-1357/7 345 316/4-378/2 175/5 141/1- 218/8 فرکشن ان-بوتانولی585/2 535/2-1235/4 83/2 76/1-52/8 255/6 224/2-322/5 فرکشن اتیل استاتی581/2 712/6-3521/3 43/8 (41/1-46/8) 244/7 218/8-286/8 4-4تاثیر عصاره هیدروالکلی برگ دم اسب و فرکشن های ان برالقاء آپوپتوز در سلول های توموری به روش فلوسایتومتری سلول های AGSو PC3با غلظت های IC50عصاره و فراکسیون های ان تیمار و به مدت 48ساعت در شرایط استاندارد انکوبه شدند. پس از آماده سازی سلولها با کیت مربوطه و افزودن آنتی بادی ضد AnnexinVو رنگ ،PIاز روش فلوسایتومتری برای بررسی آپوپتوز سلولها استفاده گردید. بررسی نتایج فلوسیتومتری نشان داد که عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیون های ان مرگ سلولی بواسطه اپوپتوز را القا می کنند. درصد اپوپتوز در سلول های تیمار شده با عصاره تام وفراکسیون های ان-هگزانی ، ان-بوتانولی ، ان-کلروفرمی و اتیل استاتی به ترتیب %9/19و %12/13و %53/37و %18/43و %11/7در رده سلولی %21/55, AGSو % 5/8و %26/53و % 80/35و %39/ 4در رده سلولی PC3مشاهده شد.سلول هایی که با فراکسیون های ان-بوتانولی و ان- کلروفرمی تیمار شده بودند بیشترین مهار رشد را در مجموع داشتند و میزان رنگ بیشتری نسبت به کنترل سلول را نشان دادند، درصد نکروز سلول ها ناچیز بود.لازم به ذکر است فرکشن ان-هگزانی با وجود اینکه کمترین میزان IC50را در رده سلولی PC3داراست ولی اثر مهار رشدی مناسبی بر روی سلول ها21 ندارد و سلول ها به سمت نکروز متمایل شده و اپوپتوز آنها با توجه به نتایج به دست امده ناچیز می باشد (شکل4و.)5 97.16 76.15 92.38 18.96 72.04 58.26 0.72 5.91 1.76 26.91 2.58 12.56 1.46 15.64 4.04 53.44 23.95 26.84 0.66 2.3 1.82 0.69 1.43 2.34 0 20 40 60 80 100 120 control cell Crude extract n-Hexane fraction Chloroform fraction n-Butanol fraction Remaining aqueous fraction viable late apoptotic early apoptotic necrotic A B a b c d e f22 شکل :4انالیز فلوسیتومتری میزان اپوپتوز دررده سلولی :PC3سلولهای PC3با IC50های محاسبه شده عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیونهای ان تیمار شدند و سپس با رنگ PIو FITCطبق دستورالعمل کیت نشان دار شدند و با فلوسیتومتری میزان اپوپتوز اندازه گیری شد. :Aمیزان اپوپتوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیونهای مشتق شده از ان، :Bتجزیه و تحلیل میزان اپوپتوز توسط فلوسیتومتری، :aکنترل سلول و e، d، c، bو fبه ترتیب سلول های تیمار شده با عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیون های اتیل استاتی و ان-بوتانولی ، کلروفرمی وان-هگزانی هستند. 95.81 86.2 81.97 76.41 44.88 85.1 0.85 6.86 10.1 11.08 26.27 2.26 7.88 2.33 2.2 7.35 27.1 1.08 4.61 5.73 5.16 1.85 3.82 3.2 0 20 40 60 80 100 120 control cell Crude extract n-Hexane fraction Chloroform fraction n-Butanol fraction Remaining aqueous fraction total cells% AGS viable late apoptotic early apoptotic necrotic A23 شکل :5انالیز فلوسیتومتری میزان اپوپتوز دررده سلولی :AGSسلولهای AGSبا IC50های محاسبه شده عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیونهای ان تیمار شدند و سپس با رنگ PIو FITCطبق دستورالعمل کیت نشان دار شدند و با فلوسیتومتری میزان اپوپتوز اندازه گیری شد. :Aمیزان اپوپتوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیونهای مشتق شده از ان ، :Bتجزیه و تحلیل میزان اپوپتوز توسط فلوسیتومتری ، :fکنترل سلول و d ، c ، b ، aو eبه ترتیب سلول های تیمار شده با فراکسیون های کلروفرمی ، اتیل استاتی ، ان-بوتانولی ، ان-هگزانی و عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب هستند. بحث و نتیجه گیری بعد از بیماریهای قلبی-عروقی سرطان را میتوان بعنوان دومین عامل مرگ و میر در سال های اخیر، در جهان به شمار اورد( .)27به دلیل عوارض جانبی نامطلوب ترکیبات سنتتیک دارویی، به خصوص در داروهای شیمی درمانی تمایل به سمت مصرف گیاهان دارویی بیشتر شده است( .)28سرطان معده در مراحل اولیه اغلب بدون علایم بالینی می باشد. فقدان علایم بالینی باعث به تاخیر افتادن تشخیص می شود. بنابر این %90-80بیماران در B24 مراحل پیشرفته بیماری مراجعه کرده که دارای متاستاز مجاور هستند. طبق مطالعات اپیدمیولوژی انجام شده شانس زنده بودن در مراحل پیشرفته همراه متاستاز با وجود شیمی درمانی و درمانهای تهاجمی مانند جراحی ها به مدت 5سال ، بسیار ضعیف بوده است( .)29در کشورهای توسعه یافته سرطان پروستات دومین سرطان رایج (بعد از پوست) و دومین سرطان مرگ اور (بعد از ریه) در مردان است. از هر شش مرد یک نفر به این سرطان مبتلا میشود (.)31 .30 در این مطالعه فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفرکسیون های مشتق شده از ان بررسی گردید، نتایج ما به طور معنا داری اثرات کشندگی وابسته به دوز و زمان را در 2رده سلول های سرطانی انسانی( pc3سرطان پروستات) و( AGSسرطان معده) در شرایط in vitroنشان دادند. به دنبال تیمار سلول ها با عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر اساس مدل رگرسیون پروبیت فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام در 3رده سلولی مورد مطالعه ( )AGS, pc3,HDFsبه طور معنا داری تفاوت بودند( ،)P < 0.001هم چنین میزان IC50عصاره تام برگ دم اسب در رده های سلولی ( pc3)159.1μg·mL−1و(AGS)67.3 μg·mL−1 کمتر از رده سلولی ( HDFs) μg·mL−1994.2مشاهده گردید(جدول .)3تحقیقات بسیاری در سراسر دنیا در جهت کشف ترکیبات طبیعی که می توانند باعث مهار یا پیشگیری روند سرطان گردند در حال انجام می باشند( .)37-32تمام گونه های Equisetum sppبه عنوان منبع زیستی مهمی در طب سنتی برای درمان امراض مختلف مورد استفاده قرار میگیرند. طبق مطالعات انجام شده ترکیب هیدروالکلی استخراج شده از دو گونه E .telmateiaو E. palustreدارای خاصیت ضد میکروبی میباشد و باعث التیام زخمهای سطحی می شود(.)38 عصاره هیدروالکلی گیاه دم اسب دارای اثار تسکین دهندگی و ضد تشنج، ضد التهاب، ضد میکروبی و ضد درد نیز هست ( .)40 .39همچنین ثابت شده است که سیلیس موجود درگیاه دم اسب از رسوب چربی در شریانها نیز جلوگیری نموده و با تاثیر بر استحکام کلاژن ، رشد مجدد وقابلیت ارتجاعی بافتهای پیوندی را تقویت میکند( .)41مشخص شده عصاره متانولیک از طریق تغییراتی که در سلولهای بتای بافت کبد موشهای دیابتی شده ایجاد مینماید دارای خاصیت انتی دیابتی میباشد( .)42علاوه بر این عصاره هیدروالکلی این گیاه در برطرف کردن اختلالات شناختی در رتهای مسن و بهبود حافظه کوتاه مدت و بلند مدت موثر قلمداد شده است( .)43همچنین وجود بافر فسفات در عصاره سه گونه E. ramosissimum, E. arvense, E. telmateia باعث از بین رفتن رادیکالهای ازاد میشود که نشان میدهد خاصیت انتی اکسیدانی دارد( .)44خاصیت ضد سرطانی عصاره استخراج شده از گونه E. arvenseو اثر ان، بخصوص در توقف رشد تومورهای بدخیم پستان نیز ثابت شده است( ،)45این اثار ممکن است در نتیجه خاصیت انتی اکسیدانی عصاره و تاثیر ان بر بنیانهای قوی سوپر اکسید و رادیکالهای ازاد باشد(.)46 .4425 در این مطالعه از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب با استفاده از روش پارتیشنینگ حلال در حلال، و با بهره گیری از تفاوت در قطبیت متابولیتهای ثانویه مختلف، فراکسیونهای مختلفی از عصاره تام که پلاریته آنها با یکدیگر متفاوت است تهیه شد. طبق نتایج بدست امده فراکسیون های مشتق شده از عصاره تام برگ دم اسب بر روی رده های سلولی pc3و AGSاثرات مهار رشدی وابسته به دوز، با مقدار IC50کمتر از عصاره هیدروالکلی تام را در محیط ازمایشگاه نشان می دهند. برای سنجش و تعیین میزان القا اپوپتوز توسط عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان سلول ها با غلظت محاسبه شده به مدت 48ساعت تیمار شدند و سپس طبق کیت فلوسیتومتری اماده و انالیز گردیدند ، نتایج نشان داد که عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان مرگ سلولی را ازطریق اپوپتوز القا می کنند. رده سلول های AGSو pc3تیمار شده به ترتیب با فراکسیون های ان-بوتانولی و ان-کلروفرمی میزان FITCبیشتری را نسبت به کنترل سلول نشان دادند، درصد اپوپتوز در سلول های تیمار شده با عصاره تام وفراکسیون های ان-هگزانی ، ان-بوتانولی ، ان- کلروفرمی و اتیل استاتی به ترتیب %9/19و %12/13و %53/37و %18/43و %11/7در رده سلولی AGSو %21/55و %5/8و %26/53و %80/35و %39/4در رده سلولی PC3گزارش شد ، درصد نکروز نیز ناچیز بود(شکل4و .)3با توجه به اینکه اثر ضد توموری و همچنین القای آپوپتوز با افزایش قطبیت فرکشن ها افزایش یافته که این مطابق با افزایش میزان ترکیبات فنلی می باشد احتمالا این اثرات مربوط به ترکیبات فنلی موجود دراین عصاره و فرکشن های آن می باشد. جهت بررسی ترکیب موثر موجود دراین عصاره و فرکشن های مختلف ان نیاز به مطالعات جامع تری می باشد. نتایج این مطالعه و سایر تحقیقات منتشر شده نشان می دهد که فراکسیون های بوتانولی و کلروفرمی عصاره برگ دم اسب از طریق القا اپوپتوز دارای فعالیت ضد تکثیری در سلول های سرطانی مورد مطالعه می باشند، بنابراین برخی از این عصاره هاو فرکشن های انها به منظور توسعه داروهای ضد سرطان در اینده می توانند مورد استفاده قرار گیرند. با این حال تحقیقات بیشتری در این زمینه برای یافتن ترکیبات موثر عصاره ها و مکانیسم های ضد سرطانی انها مورد نیاز بحث و نتیجه گیری ا توجه به مشخص شدن خواص ضد سرطانی عصاره برگ گیاه دم اسب و فراکسیونهای بوتانولی و کلروفرمی ان در این تحقیق:26 -1ترکیبات موثر این عصاره و فرکشن های ان به صورت جزیی استخراج و اثرات دقیق ضد سرطانی انها دررده سلول های سرطانی دیگر نیز بررسی گردد. -2مکانیسم اثر این عصاره و فرکشن های ان بررسی گردند. -3ترکیبات موثره عصاره و فرکشن های ان استخراج و بررسی گردند. -4تا این مرحله نتایج بدست امده در حد in vitroوکشت سلولی می باشد لذا پیشنهاد می شود به منظور تایید نتایج از مدل های حیوانی استفاده گردد،در صورت تایید نتایج در این مدل ها در اینده می توان از پتانسیل خوب این ترکیبات بعنوان دارو درمانی به منظور درمان های ترکیبی سرطان استفاده نمود.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها در این مطالعه تاثیر عصاره تام و فرکشن های مختلف برگ گیاه دم اسب بر میزان پرولیفریشن و آپوپتوزیس بر روی یک رده سلولی از ادنوکارسینوما معده به نام AGSو یک رده سلولی از پروستات کانسر به نام pc3مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا لازم بود اثرات مهاری رشد (ضد پرولیفراسیون) یا سمیت (توکسیسیتی) هر کدام از عصاره و فرکشن ها مشخص شود، که از تست MTTبه این منظور استفاده شد. در مرحله بعد مکانیسم اثرات عصاره تام و فرکشن های ان به لحاظ القای آپوپتوز بررسی گردید. در هر مورداز کیت به همراه بررسی نتایج به روش فلوسیتومتری استفاده گردید. نهایتا اثرات عصاره تام و فرکشن های ان به روش MTTو با بهره گیری از نرم افزار ) SPSS(20مورد مطالعه قرار گرفت.13 1-4خواص فیتوشیمیایی عصاره تام و فرکشن های مختلف برگ گیاه دم اسب در این مطالعه ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره تام برگ دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان به روش DPPH انجام گرفت و باهم مقایسه شد، در این بین فراکشن اتیل استات با ( IC50غلضت مهار رادیکال آزاد 50 درصد) 5/25±0/75میکروگرم/ میلی لیتر دارای بیشترین و فراکشن ان هگزانی با 834/1±8/6 IC50میکروگرم/ میلی لیتر داری کمترین ظرفیت آنتی اکسیدانی است(جدول شماره .)1همچنین میزان فنول تام با روش فولین سیوکالتیو برحسب منحنی استاندارد گالیک اسید اندازه گیری و محاسبه شد که فرکشن اتیل استات با فنول 509میلی گرم گالیک اسید به گرم عصاره دارای بیشترین و ان هگزان با فنول 24/6میلی گرم گالیک اسید به گرم عصاره دارای کمترین میزان فنول تام بودند.از لحاظ آماری، ارتباط معنی داری ( )P<0/05بین فعالیت انتی اکسیدانی و محتوی فنولی عصاره و فرکشن ها مشاهده گردید.بر اساس نتایج این مطالعه میتوان اذعان داشت فرکشن اتیل استاتی گیاه دم اسب از ترکیبات فنولی بیشتری برخوردار است و هم چنین ظرفیت تام انتی اکسیدانی بالاتری دارد.با توجه به اینکه ترکیبات فنولی جز ترکیبات قطبی میباشند ،در فرکشن های قطبی نیز استخراج و رویت شدند. در ضمن بر اساس یافته های حاصل از اندازه گیری فلاونوئید که به روش کلرید آلومینیوم اندازه گیری و بر اساس منحنی استاندارد روتین محاسبه شد، فرکشن کلروفرمی با 123/4و فراکشن ان هگزان با 21/8میلی گرم روتین بر گرم عصاره به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان فلاونوئید هستند(جدول شماره.)214 جدول:1ظرفیت انتی اکسیدانی عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان به DPPH روش Sample Concentration (μg/ml ) Scavenging of DPPH radical activity inhibition (%) (main ± SEM) DPPH-radical scavenging activity IC50 / (μg/ml ) عصاره تام دم اسب 125 94/8±1/8 22/7±2/4 62/5 89/5±2/2 31/25 53/7±2/6 15/62 31/4±3.2 7/8 16/7±9.1 3/9 8 فرکشن ان-هگزان 1000 62/9±2/4 834/1±8/6 500 29/5±1/3 250 7/7±1/24 125 6/2±0/85 62/5 4±0/4 فرکشن کلروفرم 175 72/5±2/63 92/9±5/7 87/5 40/1±1/45 43/75 29/5±2/1 21/9 18/7±1/69 10/9 7/4±0/47 فرکشن اتیل استات 100 93/9±2/36 5/25±0/75 50 94/4±1/49 25 90/1±0/87 12/5 88/7±2/38 6/25 53/15±2/55 فرکشن ان-بوتانول 100 95/3±1/78 18/43±2/38 50 77/7±2/63 25 25/9±3/25 12/5 30/85±2/5 6/25 22/3±1/3415 بوتیل هیدروکسی تولوئن 200 90/2±1/2 33/5±3/67 100 78/2±3/5 50 55/6±0/99 25 37±2/35 12/5 22/9±1/63 6/25 15/2±2 3/125 12/3±1/76 جدول شماره :2خواص فیتو شیمیایی فنول و فلاونوئید عصاره هیدروالکی برگ گیاه دم اسب و فرکشن های مشتق شده از ان فنول تام نمونه )میلی گرم گالیک اسید بر گرم عصاره( فلاونوئید )میلی گرم روتین بر گرم عصاره( 140/8 50/5عصاره تام دم اسب 24/6 21/8فرکشن ان-هگزان 42 123/4فرکشن کلروفرم 509 79/2فرکشن اتیل استات 169/2 31/7فرکشن ان-بوتانول16 2-4تاثیرمهاررشدی عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب بر روی سلولهای pc3 ،AGSوHDFs به منظور بررسی فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب در رده های سلولی AGSو pc3 (سرطانی)و ( HDFsطبیعی) ابتدا پس از شمارش، رده های سلولی مورد نظر داخل پلیت 96خانه کشت داده شد، به طوری که در داخل هر حفره 5000سلول به همراه 100میکرولیتر محیط کشت، قرار داده شد. بعد از 24 ساعت سلول ها با غلظت های مختلف عصاره گیاه در زمان های 48 ،24و 72ساعت انکوبه شدند و زیستایی سلول ها با روش MTTاندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که زیستایی سلول به صورت قابل توجهی وابسته به زمان و هم چنین کاهش دوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب است (شکل .)1بر اساس مدل رگرسیون پروبیت، فعالیت ضد تکثیری عصاره تام در 3رده سلولی مورد مطالعه تفاوت چشمگیری ( )P>0/001داشتند (شکل .)1 3-4اثرمهار رشدی فرکشنهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی برگ گیاه دم اسب بر روی سلولهای HDFs وpc3 ،AGS پس از تهیه عصاره تام گیاهی ، عصاره تغلیظ شده گیاه مجددا در متانول 70درصد حل شد و سپس از طریق روش پارتیشنینگ حلال در حلال، و با بهره گیری از تفاوت در قطبیت متابولیتهای ثانویه مختلف، فراکسیونهای مختلفی از عصاره تام که پلاریته آنها با یکدیگر متفاوت است تهیه گردید، سپس سلول ها با غلظت های مختلف فراکسیون های ان-بوتانولی ، کلروفرمی،ان-هگزانی و اتیل استاتی به مدت72و48و 24ساعت تیمار شدند و با استفاده از روش MTTمورد بررسی قرار گرفتند، نتایج میانگین ± انحراف معیار .n=3انالیزداده ها با استفاده از مدل رگرسیون پروبیت نشان دهنده تفاوت معنا دار، فعالیت ضد تکثیری فراکسیون های مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بین رده های سلولی سرطانی( PC3و ) AGSوغیرسرطانی( )HDFsبود ( .)P>0/05زیستایی سلول در هر 2رده سلولی سرطانی تیمار شده با فراکسیون های مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام دم اسب وابسته به کاهش دوز و زمان تیمار بود و اثر مهار تکثیری فراکسیون ها بعد از تیمار رده های سلولی در زمان های مختلف مشاهده شد، در رده سلولی PC3فرکشن ان-هگزانی با وجود کمترین میزان انتی اکسیدانی و خواص فنولی،پایین ترین میزان IC50را در بین سایر فرکشن ها و عصاره تام داشت که احتمالا به دلیل سمیت این فرکشن بر روی این رده و پیشبرد سلول ها به سمت نکروز می باشد (نتایج فلوسیتومتری هم موید این نظریه می باشد و میزان اپوپتوز این فرکشن بر روی این رده سلولی هم پایین بود)(شکل 3و.)217 بر اساس مدل رگرسیون پروبیت،فعالیت ضد تکثیری فراکسیون ها در هر 3رده سلولی مورد مطالعه به صورت قابل ملاحضه ای متفاوت بودند( .)P>0/01پس از انجام تست های اولیه بر اساس سرعت رشد رده های سلولی 48ساعت به عنوان بهترین زمان برای بررسی اثرات توکسیسیتی عصاره تام و فرکشن های ان انتخاب شدو میزان IC50های اندازه گیری شده با 48ساعت انکوباسیون، عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان برروی رده های سلولی AGSو PC3کمتر از رده سلولی HDFsبودند (جدول شماره.) 3 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 viability% concentrationµg/ml AGS 48 24 72 Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h شکل :1مقایسه تاثیر غلظت عصاره هیدروالکلی تام دم اسب بر میزان بقا سلولی در زمان های مختلف ،24 48و 72ساعت تیمار سلولها بر 2رده سلولی سرطانی(AGSو )PC3و رده نرمال سلولی : HDFsیافته ها نشان دهنده تاثیر مهارکنندگی عصاره بر رشد سلولی وابسته به زمان است و همچنین فعالیت ضد تکثیری عصاره تام در 3رده سلولی مورد مطالعه تفاوت چشمگیری()P>0/001داشت. رده سلولی PC318 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 24h 48h 72h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 50 100 150 200 Viability% concentration µg/ml 48h 24h 72h شکل :2اثار مهار رشد فراکسیونهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر رده سلول های سرطانی AGSدر زمان های مختلف تیمار.19 Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h Concentration (µg/ml) Viability (%) 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h شکل:3اثار مهار رشد فراکسیونهای مشتق شده از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر رده سلول های سرطانی PC3در زمان های مختلف تیمار. اتیل استاتی ان-هگزانی ان-بوتانولی کلروفرمی20 جدول :3میزان IC50عصاره تام هیدروالکلی برگ دم اسب وفراکسیونهای مشتق شده ازان در 3رده سلولی مورد مطالعه. رده سلولی فرکشن/عصاره HDFs (μg/ml) AGS (μg/ml) PC3(μg/ml) فاصله اطمینان IC50 %55فاصله اطمینان IC50 %55فاصله اطمینان IC50 %55 عصاره تام دم اسب554/2 562/6-1225/7 6773 62/2-75/2 155/1 132-186/5 فرکشن ان-هگزانی743/4 558/7-547/1 51/8 28/5-72/3 87/4 72/5-124/4 > فرکشن کلروفرمی1222 853/1-1357/7 345 316/4-378/2 175/5 141/1- 218/8 فرکشن ان-بوتانولی585/2 535/2-1235/4 83/2 76/1-52/8 255/6 224/2-322/5 فرکشن اتیل استاتی581/2 712/6-3521/3 43/8 (41/1-46/8) 244/7 218/8-286/8 4-4تاثیر عصاره هیدروالکلی برگ دم اسب و فرکشن های ان برالقاء آپوپتوز در سلول های توموری به روش فلوسایتومتری سلول های AGSو PC3با غلظت های IC50عصاره و فراکسیون های ان تیمار و به مدت 48ساعت در شرایط استاندارد انکوبه شدند. پس از آماده سازی سلولها با کیت مربوطه و افزودن آنتی بادی ضد AnnexinVو رنگ ،PIاز روش فلوسایتومتری برای بررسی آپوپتوز سلولها استفاده گردید. بررسی نتایج فلوسیتومتری نشان داد که عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیون های ان مرگ سلولی بواسطه اپوپتوز را القا می کنند. درصد اپوپتوز در سلول های تیمار شده با عصاره تام وفراکسیون های ان-هگزانی ، ان-بوتانولی ، ان-کلروفرمی و اتیل استاتی به ترتیب %9/19و %12/13و %53/37و %18/43و %11/7در رده سلولی %21/55, AGSو % 5/8و %26/53و % 80/35و %39/ 4در رده سلولی PC3مشاهده شد.سلول هایی که با فراکسیون های ان-بوتانولی و ان- کلروفرمی تیمار شده بودند بیشترین مهار رشد را در مجموع داشتند و میزان رنگ بیشتری نسبت به کنترل سلول را نشان دادند، درصد نکروز سلول ها ناچیز بود.لازم به ذکر است فرکشن ان-هگزانی با وجود اینکه کمترین میزان IC50را در رده سلولی PC3داراست ولی اثر مهار رشدی مناسبی بر روی سلول ها21 ندارد و سلول ها به سمت نکروز متمایل شده و اپوپتوز آنها با توجه به نتایج به دست امده ناچیز می باشد (شکل4و.)5 97.16 76.15 92.38 18.96 72.04 58.26 0.72 5.91 1.76 26.91 2.58 12.56 1.46 15.64 4.04 53.44 23.95 26.84 0.66 2.3 1.82 0.69 1.43 2.34 0 20 40 60 80 100 120 control cell Crude extract n-Hexane fraction Chloroform fraction n-Butanol fraction Remaining aqueous fraction viable late apoptotic early apoptotic necrotic A B a b c d e f22 شکل :4انالیز فلوسیتومتری میزان اپوپتوز دررده سلولی :PC3سلولهای PC3با IC50های محاسبه شده عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیونهای ان تیمار شدند و سپس با رنگ PIو FITCطبق دستورالعمل کیت نشان دار شدند و با فلوسیتومتری میزان اپوپتوز اندازه گیری شد. :Aمیزان اپوپتوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیونهای مشتق شده از ان، :Bتجزیه و تحلیل میزان اپوپتوز توسط فلوسیتومتری، :aکنترل سلول و e، d، c، bو fبه ترتیب سلول های تیمار شده با عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیون های اتیل استاتی و ان-بوتانولی ، کلروفرمی وان-هگزانی هستند. 95.81 86.2 81.97 76.41 44.88 85.1 0.85 6.86 10.1 11.08 26.27 2.26 7.88 2.33 2.2 7.35 27.1 1.08 4.61 5.73 5.16 1.85 3.82 3.2 0 20 40 60 80 100 120 control cell Crude extract n-Hexane fraction Chloroform fraction n-Butanol fraction Remaining aqueous fraction total cells% AGS viable late apoptotic early apoptotic necrotic A23 شکل :5انالیز فلوسیتومتری میزان اپوپتوز دررده سلولی :AGSسلولهای AGSبا IC50های محاسبه شده عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفراکسیونهای ان تیمار شدند و سپس با رنگ PIو FITCطبق دستورالعمل کیت نشان دار شدند و با فلوسیتومتری میزان اپوپتوز اندازه گیری شد. :Aمیزان اپوپتوز عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فراکسیونهای مشتق شده از ان ، :Bتجزیه و تحلیل میزان اپوپتوز توسط فلوسیتومتری ، :fکنترل سلول و d ، c ، b ، aو eبه ترتیب سلول های تیمار شده با فراکسیون های کلروفرمی ، اتیل استاتی ، ان-بوتانولی ، ان-هگزانی و عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب هستند. بحث و نتیجه گیری بعد از بیماریهای قلبی-عروقی سرطان را میتوان بعنوان دومین عامل مرگ و میر در سال های اخیر، در جهان به شمار اورد( .)27به دلیل عوارض جانبی نامطلوب ترکیبات سنتتیک دارویی، به خصوص در داروهای شیمی درمانی تمایل به سمت مصرف گیاهان دارویی بیشتر شده است( .)28سرطان معده در مراحل اولیه اغلب بدون علایم بالینی می باشد. فقدان علایم بالینی باعث به تاخیر افتادن تشخیص می شود. بنابر این %90-80بیماران در B24 مراحل پیشرفته بیماری مراجعه کرده که دارای متاستاز مجاور هستند. طبق مطالعات اپیدمیولوژی انجام شده شانس زنده بودن در مراحل پیشرفته همراه متاستاز با وجود شیمی درمانی و درمانهای تهاجمی مانند جراحی ها به مدت 5سال ، بسیار ضعیف بوده است( .)29در کشورهای توسعه یافته سرطان پروستات دومین سرطان رایج (بعد از پوست) و دومین سرطان مرگ اور (بعد از ریه) در مردان است. از هر شش مرد یک نفر به این سرطان مبتلا میشود (.)31 .30 در این مطالعه فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب وفرکسیون های مشتق شده از ان بررسی گردید، نتایج ما به طور معنا داری اثرات کشندگی وابسته به دوز و زمان را در 2رده سلول های سرطانی انسانی( pc3سرطان پروستات) و( AGSسرطان معده) در شرایط in vitroنشان دادند. به دنبال تیمار سلول ها با عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب بر اساس مدل رگرسیون پروبیت فعالیت ضد تکثیری عصاره هیدروالکلی تام در 3رده سلولی مورد مطالعه ( )AGS, pc3,HDFsبه طور معنا داری تفاوت بودند( ،)P < 0.001هم چنین میزان IC50عصاره تام برگ دم اسب در رده های سلولی ( pc3)159.1μg·mL−1و(AGS)67.3 μg·mL−1 کمتر از رده سلولی ( HDFs) μg·mL−1994.2مشاهده گردید(جدول .)3تحقیقات بسیاری در سراسر دنیا در جهت کشف ترکیبات طبیعی که می توانند باعث مهار یا پیشگیری روند سرطان گردند در حال انجام می باشند( .)37-32تمام گونه های Equisetum sppبه عنوان منبع زیستی مهمی در طب سنتی برای درمان امراض مختلف مورد استفاده قرار میگیرند. طبق مطالعات انجام شده ترکیب هیدروالکلی استخراج شده از دو گونه E .telmateiaو E. palustreدارای خاصیت ضد میکروبی میباشد و باعث التیام زخمهای سطحی می شود(.)38 عصاره هیدروالکلی گیاه دم اسب دارای اثار تسکین دهندگی و ضد تشنج، ضد التهاب، ضد میکروبی و ضد درد نیز هست ( .)40 .39همچنین ثابت شده است که سیلیس موجود درگیاه دم اسب از رسوب چربی در شریانها نیز جلوگیری نموده و با تاثیر بر استحکام کلاژن ، رشد مجدد وقابلیت ارتجاعی بافتهای پیوندی را تقویت میکند( .)41مشخص شده عصاره متانولیک از طریق تغییراتی که در سلولهای بتای بافت کبد موشهای دیابتی شده ایجاد مینماید دارای خاصیت انتی دیابتی میباشد( .)42علاوه بر این عصاره هیدروالکلی این گیاه در برطرف کردن اختلالات شناختی در رتهای مسن و بهبود حافظه کوتاه مدت و بلند مدت موثر قلمداد شده است( .)43همچنین وجود بافر فسفات در عصاره سه گونه E. ramosissimum, E. arvense, E. telmateia باعث از بین رفتن رادیکالهای ازاد میشود که نشان میدهد خاصیت انتی اکسیدانی دارد( .)44خاصیت ضد سرطانی عصاره استخراج شده از گونه E. arvenseو اثر ان، بخصوص در توقف رشد تومورهای بدخیم پستان نیز ثابت شده است( ،)45این اثار ممکن است در نتیجه خاصیت انتی اکسیدانی عصاره و تاثیر ان بر بنیانهای قوی سوپر اکسید و رادیکالهای ازاد باشد(.)46 .4425 در این مطالعه از عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب با استفاده از روش پارتیشنینگ حلال در حلال، و با بهره گیری از تفاوت در قطبیت متابولیتهای ثانویه مختلف، فراکسیونهای مختلفی از عصاره تام که پلاریته آنها با یکدیگر متفاوت است تهیه شد. طبق نتایج بدست امده فراکسیون های مشتق شده از عصاره تام برگ دم اسب بر روی رده های سلولی pc3و AGSاثرات مهار رشدی وابسته به دوز، با مقدار IC50کمتر از عصاره هیدروالکلی تام را در محیط ازمایشگاه نشان می دهند. برای سنجش و تعیین میزان القا اپوپتوز توسط عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان سلول ها با غلظت محاسبه شده به مدت 48ساعت تیمار شدند و سپس طبق کیت فلوسیتومتری اماده و انالیز گردیدند ، نتایج نشان داد که عصاره هیدروالکلی تام برگ دم اسب و فرکشن های ان مرگ سلولی را ازطریق اپوپتوز القا می کنند. رده سلول های AGSو pc3تیمار شده به ترتیب با فراکسیون های ان-بوتانولی و ان-کلروفرمی میزان FITCبیشتری را نسبت به کنترل سلول نشان دادند، درصد اپوپتوز در سلول های تیمار شده با عصاره تام وفراکسیون های ان-هگزانی ، ان-بوتانولی ، ان- کلروفرمی و اتیل استاتی به ترتیب %9/19و %12/13و %53/37و %18/43و %11/7در رده سلولی AGSو %21/55و %5/8و %26/53و %80/35و %39/4در رده سلولی PC3گزارش شد ، درصد نکروز نیز ناچیز بود(شکل4و .)3با توجه به اینکه اثر ضد توموری و همچنین القای آپوپتوز با افزایش قطبیت فرکشن ها افزایش یافته که این مطابق با افزایش میزان ترکیبات فنلی می باشد احتمالا این اثرات مربوط به ترکیبات فنلی موجود دراین عصاره و فرکشن های آن می باشد. جهت بررسی ترکیب موثر موجود دراین عصاره و فرکشن های مختلف ان نیاز به مطالعات جامع تری می باشد. نتایج این مطالعه و سایر تحقیقات منتشر شده نشان می دهد که فراکسیون های بوتانولی و کلروفرمی عصاره برگ دم اسب از طریق القا اپوپتوز دارای فعالیت ضد تکثیری در سلول های سرطانی مورد مطالعه می باشند، بنابراین برخی از این عصاره هاو فرکشن های انها به منظور توسعه داروهای ضد سرطان در اینده می توانند مورد استفاده قرار گیرند.

فایل های پژوهش