پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله تومورها ساختاری سه بعدی دارند و متشکل از سلولها، ماتری کس خارج سلولی و عروق خونی هستند(1). بنابرای ن در مطالعات سرطان در محی ط آزمای شگاه، بسی ار مهم است که ای ن ساختار سه بعدی شبی ه سازی شود تا نتای ج واقعی تری به دست آی د. مبانی مهندسی بافت ای ن امکان را فراهم آورده اند که بتوان سلولها را در ی ک محی ط سه بعدی طراحی شده ی ا طبی عی کشت داد. اخی را توجه زی ادی به ای ن امر شده و مدلهای مختلفی برای شبی ه سازی سه بعدی تومورهای مختلف مطالعه و پی شنهاد شده است. مطالعات حاکی از تاثی رچشمگی ر محی ط سه بعدی بر رشد و بقای سلولهای توموری و پاسخ متفاوت ای ن سلولها به درمان در مقای سه با محی ط دو بعدی است(2-6). ی کی از روشهای مهم کشت سه بعدی استفاده ازداربستهای طبی عی سلول زدای ی شده است(7). ای ن داربستها را می توان از بافتهای مختلف بدن پس از حذف سلولهای بافت به دست آورد و سپس سلولهای مورد نظر را روی آن کشت داد. سرطان معده، بیماری بدخیمی است که شیوع بسیار بالایی دارد. وجود سرطان در بخشی از معده می تواند به سرتاسر معده و اندامهایی دیگر همچون مری، ریه ها، غدد لنفی یا کبد پراکنده شود (8). پیشرفت و گسترش سرطان معده از طریق چندین جهش ژنتیکی در پروتوانکوژنها و ژنهای بازدارنده تومور ایجاد می شود(9). با وجود کاهش بروز کلی و میزان مرگ و میر ناشی از سرطان معده در طول 50 سال گذشته، این سرطان هنوز چهارمین بدخیمی شایع و دومین علت اصلی مرگ مرتبط با سرطان، در هر دو جنس زن و مرد، در سراسر جهان است (8و10و11). مفهوم سلولهای بنیادی سرطانی (CSCs) از یک دهه پیش ایجاد شده است و بیان کننده زیر گروهی از سلولهای سرطانی می باشد که در سرطان های خونی و نیز تومورهای جامد یافت می شوند و ویژگیهایی شبیه سلولهای بنیادی دارند؛ به ویژه آنکه توانایی ایجاد همه انواع سلولهایی که در یک نمونه سرطان ویژه یافت می شوند را دارا هستند. از طرفی سلول های بنیادی سرطانی (CSCs)، دارای ویژگی خود تجدید کنندگی هستند(12). بنابراین سلولهای بنیادی سرطانی، تومورژنیک (شکل دهنده تومور) هستند(13). مارکر CD44 در مطالعه گلستانه و همکاران، در رده سلولی سرطان معده (MKN-45) به تنهای ی برای جداسازی سلول های بنیادی سرطانی با موفقیت استفاده شد (14). DOCو دی گر تاکسانها، داروهای شی می درمانی هستند که با اتصال به می کروتوبولها و تغی ی ر شکل گی ری اسکلت سلولی و سی گنالی نگ سلولی عمل می کند و اثر درمانی آن، منجر به فسفری لاسی ون پروتئی ن آنتی آپوپتوتی ک Bcl2 می گردد.. عملکرد سای توتوکسی تی ای ن مواد، تاثی ر بر ثبات می کروتوبولها است (15). می کروتوبولها، پلی مرهای هستند که از هترودای مرهای الفا و بتا تشکی ل شده اند. ای ن پلی مرها، برای تقسی م سلولی ضروری هستند و توسط Docetaxel مورد هدف گی ری قرار می گی رند. می کروتوبولها در طی می توز پلی مری زه می شوند و تقسی م دقی ق کروموزومها را در بی ن سلولهای دختری باعث می گردند. DOC و دی گر تاکسانها با اتصال به می کروتوبولها و تغی ی ر شکل گی ری اسکلت سلولی و سی گنالی نگ سلولی باعث توقف سلولها در می توز می گردند و در نهای ت سلولهای متوقف شده در می توز، دچار آپوپتوز می گردند(16). مکانی سم مقاومت به ای ن دارو هنوز بطور کامل شناسای ی نشده است (17). DOC و ترکی بات مشابه، در شی می درمانی سرطان معده بصورت گسترده ای استفاده می شوند(18). برای بررسی های سلولهای سرطانی بصورت in vitro، می توان سلولها را بصورت روتی ن دو بعدی و ی ا بصورت سه بعدی کشت داد. Gurski و همکاران در سال 2010 استفاده از ماتری کسهای سه بعدی را برای بررسی و تست کردن داروهای ضد سرطان مناسب تر گزارش کرده و علت تفاوت پاسخهای داروی ی را به چند نکته مربوط دانستند از جمله ای نکه: مورفولوژی سلولها در محی ط سه بعدی با دو بعدی متفاوت است؛ سلولها در محی ط سه بعدی با سرعت کمتری رشد می کنند و به علت گلی کولی ز بی شتر سلولها در محی ط سه بعدی ، پروفای ل ژنی متفاوت تری دارند (19). Longati و همکارانش در سال 2013 اعلام کردند سلولهای کارسی نومای پانکراس در محی ط کشت سه بعدی در مقای سه با محی ط کشت دو بعدی بی ان ژنی متفاوت و نی ز مقاومت بی شتری نسبت به داروی Alicin دارند؛ لذا پی شنهاد کردند مدل سه بعدی برای بررسی اثر داروها روی سلولهای سرطانی مناسب تر است(4). Zhang و همکاران در سال 2013 مشاهده کردند که رفتار سلولهای سرطانی ری ه در محی ط سه بعدی در مقای سه با محی ط دو بعدی متفاوت بوده و در مدل سه بعدی رشد سلولهای توموری شبی ه تر به رشد سلولهادر بدن است (1). 3-اهداف و فرضیات: 1-3- هدف کلی مقایسه مقاومت رده سلولی MKN-45به داروی Docetaxel در محیط کشت دو بعدی و سه بعدی 2-3- اهداف اختصاصی 1- تعیین مقاومت رده سلولی سرطان معده MKN-45 به داروی DOC در محیط کشت دو بعدی و سه بعدی (با استفاده از داربست سلول زدایی شده بافت معده) جهت بررسی کارایی کشت سه بعدی رده سلولی سرطان معده MKN-45 2- تولید بافت شبیه سازی شده سرطان معده جهت بررسی ها و پژوهشهای آینده3- تعیین تاثیر شرایط کشت برمقاومت دارویی رده سلولی سرطان معده MKN-453- تعیین تاثیر شرایط کشت بر سلولهای بنیادی سرطانی سرطان معده MKN-454- معرفی مدل مناسب مهندسی بافت شده برای این مطالعات. تاکنون مطالعه بر روی سلولهای سرطان معده به روش سه بعدی با استفاده از داربست طبیعی سلول زدایی شده انجام نشده است. همچنین فرضیه تاثیر این داربست بر مقاومت دارویی و فراوانی سلولهای بنیادی سرطانی در آن جدید است. 3-3- اهداف کاربردی 1- تولید بافت مهندسی شده سرطان معده ۴-۳- فرضیات و سوالات تحقیق فرضیات1- شرایط کشت (دو بعدی یا سه بعدی) بر مقاومت دارویی سلولهای سرطانی تاثیرگزار است. 2- شرایط کشت (دو بعدی یا سه بعدی) بر فراوانی سلولهای بنیادی سرطانی که سلولهای مقاوم به درمان هستند، تاثیرگزار است. 3- استفاده از کشت سه بعدی به روش مطرح شده در این مطالعه شیوه مناسبی برای بررسی مقاومت دارویی است. سوالات: 1- ایا تفاوتی در مقاومت سلولها به دارو در شرایط دو بعدی و سه بعدی وجود دارد؟2- آیا سلولهای بنیادی سرطانی عامل مقاومت سلولهای سرطانی در محیط کشت دو و سه بعدی هستند؟3- شرایط کشت (دو بعدی یا سه بعدی) چه تاثیری بر فراوانی سلولهای بنیادی سرطانی دارد؟ روش اجرا نوع مطالعه ادمین گروه ۲-۷- جمعیت مورد مطالعه ۳-۷- معیارهای ورود و خروج جمع آوری 4-7- حجم نمونه و روش نمونه گیری آزمایش در پلیت های شش خانه با غلظتهای مختلف دارو با سه تکرارانجام می شود.روش تجزیه و تحلیل داده ها : برای آنالیز داده ها از نرم افزار SPSS با تست اماری ANOVA استفاده می شود. 5-7- مکان و زمان انجام مطالعه 6-7- روش گردآوری داده‌ها و ابزار آن بررسی MTT جهت بدست آوردن IC 50 ، رنگ آمی زی هماتوکسی لی ن و ای وزی ن، انجام روشی ای مونوسی توشی می و ای منوهی ستوشی می با استفاده از آنتی بادی CD44 جهت بررسی سلولهای بنی ادی سرطانی 7-7- مشخصات ابزار جمع آوری اطلاعات و نحوه جمع آوری مراحل ازمایش سه بار تکرار میشوند و نتایج حاصل با استفاده از روش آماری SPSS مورد انالیز قرار میگیرند. برای هر غلظت، سه بار تکرار آزمایش انجام می شود. p value کمتر از 05/0 از نظر آماری معنی دار، در نظر گرفته می شود.نمونه کنترل در همه تستها سلولهای اولیه (بدون تیمار) می باشد. 8-۷- روش کار 9-7- روش تجزیه و تحلیل داده‌ها 10-7- محدودیت‌ها و مشکلات اجرایی پژوهش و روش کاهش و حل آنها با توجه به اینکه مواد و کیت های مورد نیاز از خارج کشور تهیه می شوند ممکن است در تهیه برخی با تاخیر مواجه شویم. ماهیت کشت سلول روشی وقت گیر و انرژی بر است که در همه موارد مذکور امید است با تلاش و پشتکار مرتفع گردد. همچنین تهیه داربست سلول زدایی شده و کشت سه بعدی فرایندی زمان بر است. ملاحظات اخلاقیبرای نمایش یا عدم نمایش کلیک نمایید. ملاحظات و مشکلات اخلاقی طرح در صورت استفاده از نمونه های حیوانی طبق مصوبات کمیته اخلاق عمل خواهد شد. راه حل مشکلات اخلاقی 1- تهیه و کشت سلولهای رده سرطان معده MKN-45 (دو بعدی و سه بعدی با استفاده از بافت معده سلول زدایی شده)2- بدست آوردن IC50 برای داروی (DOC) در این رده سلولی (دو بعدی و سه بعدی)3- بررسی سلولهای CD44 مثبت در کشت دو بعدی و سه بعدی آیا طرح رضایتنامه اخلاقی دارد خیر یافته ها کشت دو بعدی سطح صافی از سلولها را نشا می دهد همچین در برگیرده لایه ای پلی استیر ن رشد بوده که به سطح پلاستیکی چسبیده و تشکیل پیوندهای غیرعادی با پر<تئینهای تخریب شده در کف ظرف را می دهند که مشخص کننده محیط واقعی رشد آنها در جاداران نیست. بحث و نتیجه گیری پیام اصلی و مهمترین سیفته این مطالعه نشان دادن تفاوت معنادار مقاومت سلولهای سرطانی مورد نظر (یا جمعیت سلولهای بنیادی سرطانی که مسئول مقاومت دارویی در نظر گرفته می شوند) در شرایط استفاده از کشت سه بعدی در مقایسه با کشت دو بعدی است که این مقاومت در کشت سه بعدی بیشتر از کشت دو بعدی بود. نتیجه این مطالعه بر اهمیت و لزوم استفاده از کشت سه بعدی در تقحیقات سرطان صحه میگذارد.

خلاصه نتایج حاصله

یافته ها کشت دو بعدی سطح صافی از سلولها را نشا می دهد همچین در برگیرده لایه ای پلی استیر ن رشد بوده که به سطح پلاستیکی چسبیده و تشکیل پیوندهای غیرعادی با پر<تئینهای تخریب شده در کف ظرف را می دهند که مشخص کننده محیط واقعی رشد آنها در جاداران نیست.

فایل های پژوهش