پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

پژوهش در حوزه اثرات آنتی‌بیوتیکی و آنتی باکتریال گیاهان دارویی چندی است که به دلایلی از جمله در دسترس بودن این گیاهان، مقرون به صرفه بودن جمع‌آوری و استخراج مواد مؤثره از آنان و مهم‌تر از آن، عدم داشتن عوارض مرتبط با دارو‌های شیمیایی و سنتتیک و گرایش بسیاری از مردم به استفاده از دارو‌های گیاهی با استقبال گسترده پژوهشگران در سرتاسر جهان مواجه شده است. پژوهش حاضر اثرات آنتی باکتریال عصاره‌های هیدرو الکلی سه گیاه اسطوخودوس (Lavandula officinalis)، زیره‌ سیاه (Carum carvi) و همچنین بذر خیار (Cucumis sativa) را بر روی پاتوژن‌های بیمارستانی سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) و کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae) ارزیابی کرده است. این باکتری ها از جمله عوامل فرصت طلب مهلک بیمارستانی بوده که در بخش‌های مختلف بیمارستان و از جمله بخش‌های مراقبت ویژه سبب ناتوانی بیماران می‌گردد. برای ارزیابی خاصیت آنتی باکتریال عصاره‌های هیدروالکلی گیاهان، طبق پروتکل تعیین حساسیت میکروبی بر اساس تعیین مقادیر حداقل غلظت مهرکنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) عمل شد. هدف از انجام این مطالعه تجربی بررسی اثرات عصاره های هیدرو الکلی گیاهان هم در حالت منفرد و هم در حالت ترکیب دو و سه عصاره گیاهی بر روی سوش های میکروبی بود. به عنوان نمونه برای باکتری سودوموناس آئروژینوزا، مقادیر MIC برای هرکدام از عصاره های گیاهان زیره سیاه، اسطوخودوس و بذر خیار به ترتیب 2، 8 و 16 mg/cc بدست آمد. این مقادیر برای عصاره های گیاهی به صورت ترکیب دوتایی زیره سیاه و اسطوخودوس، زیره سیاه و بذر خیار و اسطوخودوس و بذر خیار به ترتیب برابر با 16، 32 و 64 mg/cc بود. در ترکیب سه تایی گیاهان با یکدیگر مقدار MIC، 32 mg/cc بدست آمد. اگرچه عصاره های گیاهی حاوی مقادیر قابل توجهی از فیتوکمیکال ها نظیر فلاوونوئید ها، ساپونین ها، ترپن ها و بسیاری دیگر از ترکیبات ضد باکتریایی می‌باشند اما بر اساس مطالعه حاضر انجام شده به نظر می‌رسد که حضور همگی این ترکیبات در کنار هم و در زمانی که در مجاورت با سوسپانسیون باکتری قرار می‌گیرد نه تنها اثر سینرژیسم و هم افزایی نداشته بلکه موجب آنتاگونیزه شدن اثر یکدیگر و در نتیجه بالارفتن مقدار MIC و MBC می‌شود. لذا توصیه می‌گردد در پژوهش های آتی بررسی و استخراج ترکیبات موثره گیاهی به صورت منفرد و متمرکز بر یک ترکیب شیمیایی، جهت اثردهی بهتر وصرفه جویی هرچه بیشتر در منابع مالی و تجهیزات انجام شود. 2 3 2-1. خلاصه اجرایی این پژوهش نوعی مطالعه آزمایشگاهی بوده که به بررسی اثرات عصاره های هیدروالکلی گیاهان زیره سیاه، اسطوخودوس و بذر خیار بر روی باکتری های گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه می‌پردازد. مجوز های لازم از دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد اخذ شده و تمامی آزمایش های مربوط به روش عصاره گیری، آزمایش های باکتری‌شناسی و خوانش نتایج در دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد انجام شد. جستجو انجام شده در منابع اطلاعاتی Pubmed، Science Direct، Wiley و سایر منابع کتابشناسی و نیز موتور جستجوی google scholar حاکی از وجود اثرات ضدمیکروبی این گیاهان در برابر طیفی از پاتوژن های باکتریایی و قارچی بود. در این مطالعه تصمیم گرفته شد، علاوه بر به کار بردن عصاره های گیاهی به صورت منفرد، حالت های ترکیبی آنها نیز مورد بررسی قرار گیرد. گیاهان پس از خریداری از هرباریوم در فصول مناسب خود، جهت انجام آزمایش های عصاره گیری خرد و آسیاب شده و به مدت 72 ساعت در الکل اتانول 70 درصد، که از رقیق کردن الکل 96 درصد بدست آمد، در محلی با دمای 20 درجه سانتی‌گراد و به دور از نور خورشید خیس خوردند. پس از آن با استفاده از کاغذ صافی واتمن، ترکیب عصاره و الکل از باقی مانده گیاه جدا شد و برای جداسازی الکل از عصاره تام گیاهی، محلول الکل و عصاره به دستگاه روتاری منتقل شد (شکل 4). پس از تغلیظ عصاره های هیدروالکلی، عصاره ها در پلیت های شیشه ای ریخته شده و در انکوباتور آزمایشگاه فیتوشیمی قرار داده شدند. پس از گذشت سه روز (برای اسطوخودوس پنج روز) این عصاره ها تراشیده و خرد شده و برای ساخت محلول با آب مقطر با نسبت های مطلوب ترکیب شدند. سوش استاندارد باکتری گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا Pseudomonas aeruginosa با ATCC 27853 و کلبسیلا پنومونیه Klebsiella pneumoniae با ATCC 10031 از سازمان پژوهش‌ های علمی و صنعتی ایران خریداری و پس از انجام آزمایش های تاییدی بر روی سوش، جهش استفاده بر روی محیط Blood Agar کشت داده شد. پس انجام تست های لاکتاز، اکسیداز، سیترات، ایندول و متیل رد، و انجام تست Oxidation-fermentation و اکسیداسیون گلوکز، تشخیص آزمایشگاهی سودوموناس آئروژینوزا محقق شد. 4 در مرحله بعد کلنی های باکتری که دارای جلای فلزی سبز رنگ بر روی محیط CN بوده و باسیل های گرم منفی مشاهده شده در زیر میکروسکوپ تشخیص قطعی باکتری را مسلم ساخت. تشخیص باکتری کلبسیلا پنومونیه نیز با مشاهده کلنی های صورتی رنگ موکوئیدی بر روی محیط کشت مک کانکی آگار محقق شد. برای تعیین کمی میزان حساسیت میکروبی، از روش Broth microdilution استفاده شد. به این صورت که رقت‌های مختلف عصاره در مجاورت مستقیم با محلول سوسپانسیون باکتری و محیط کشت آن قرار می‌گیرد و بر اساس ایجاد یا عدم ایجاد کدورت، که به معنای رشد یا عدم رشد باکتری است، مقدار حداقل غلظت مهارکنندگی رشد باکتری یا MIC (Minimum Inhibitory Concentration) بدست می‌آید. بدین منظور بر اساس پروتوکل استاندارد روش Broth microdilution رقت اولیه mg/cc 1024 از عصاره تهیه و پس از آن با روش serial dilution، توان های دو از رقت عصاره شامل mg/cc 512 ، mg/cc 256، mg/cc 128، mg/cc 64، mg/cc 32، mg/cc 16، mg/cc 8، mg/cc 4 و mg/cc 2 تهیه شد. همچنین سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری سودوموناس آئروژینوزا CFU/ml 108 × 5/1 طبق متود استاندارد، از محلول محیط کشت Muller Hinton Broth و سوش استاندارد باکتری تهیه شد. کلیه این مراحل برای باکتری کلبسیلا پنومونیه نیز تکرار شد. پلیت‌های 96 خانه ای ته صاف برای این آزمایش استفاده شدند. چاهک اول و دوم به ترتیب برای کنترل منفی (حاوی محیط کشت Muller Hinton Broth ) و کنترل مثبت (حاوی محیط کشت Muller Hinton Broth و باکتری) استفاده شدند. و رقت های اصلی عصاره از چاهک سه به بعد افزوده شدند. چاهک کنترل منفی حاوی ml200 محیط Muller Hinton Broth و چاهک کنترل مثبت حاوی ml200 از سوسپانسیون باکتری و محیط کشت بود. تمامی ده چاهک دیگر حاوی ml100محلول سوسپانسیون باکتری و محیط کشت بودند (شکل 1و2). از آنجایی که افزودن مقادیر کمتر یا بیشتر از حد لازم هر کدام از دو جز عصاره یا سوسپانسیون باکتری با ایجاد کدورت متفاوت، در خوانش نتیجه صحیح اختلال ایجاد می‌کند، لذا آزمایش ها برای هر حالت سه بار تکرار شد. همچنین در هنگام انجام آزمایش های مربوط به باکتری، کلیه نکات و قوانین استریلیزاسیون و نکات ایمنی کار با باکتری لحاظ شد (شکل 3).

خلاصه نتایج حاصله

مطالعات بافت شناسي روي بافت قلب به روش هماتوکسیلین و ائوزین با استفاده از میکروسکوپ نوری صورت گرفت. نتایج آزمایشات نشان داد که بکار بردن عصاره زعفران تأثیر معنی داری در کاهش سمیت قلبي داروي DOX داشته و سبب کاهش آنزیم های شاخص آسیب قلبی LDH و CK-MB شد. همچنین عصاره زعفران تأثیر معنی داری در کاهش سميت قلبي ناشی ازاسترس اکسیداتیو این دارو داشت بطوریکه باعث افزایش معنی دار میزان فعالیت CAT ،SOD و FRAP، شد و از طرف دیگرمیزان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی (MDA) را در سرم و بافت کاهش داد. بررسی هیستوپاتولوژیکی در لامهای پاتولوژی بافت قلب در گروههای مورد تیمار با عصاره زعفران با نتایج بیوشیمیایی نیز مطابقت داشت.

فایل های پژوهش