پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله سکته مغزی یکی از بیماریهای شایع در دنیا می باشد که بار مالی زیادی به جامعه وارد می کند. سکته مغزی سومین عامل مرگ و میر و ناتوانی در جوامع بشری می باشد. ناتوانی های فیزیکی ناشی از این بیماری به دلیل عدم ترمیم نورون های آسیب دیده ناشی از ایسکمی می باشد. . با وجود تحقیقات گسترده هنوز درمان موثری در دسترس نیست تا از آسیبهای عصبی ناشی از سکته جلوگیری کند. تاکنون هیچ درمانی وجود ندارد که اثرات ثابت شده محافظت کننده نورونی(neuroprotective) در موارد سکته داشته باشد. مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT/mTORنقش مهمی در تنظیم رشد، تکثیر، تمایز سلولی و همچنین تنظیم متابولیسم و ساخت پروتیینها دارد. بنابراین فعال کردن این مسیر سیگنالینگ می تواند باعث تحریک رشد و تمایز سلولها شود. سلژیلین (selegiline)یک مهار کننده اختصاصی آنزیم مونوآمین اکسیداز تیپ B می باشد و به صورت گسترده برای درمان بیماری پارکینسون استفاده می شود. مطالعات قبلی نشان داده اند که سلژیلین اثرات نوروتروفیک (neurotrophic) و آنتی آپوپتوتیک(anti-apoptotic) دارد و در مدلهای مختلف ایسکمی مغزی اثرات محافظت کننده نورونی از خود نشان داده است. سلژیلین در بدن به دوپامین تبدیل میشود و از طریق فعال کردن گیرنده های دوپامینی اثرات خود را یجاد میکند. تحقیقات نشان داده اند که دوپامین باعث فعال کردن AKT و در نتیجه تحریک فعالیت mTOR میشود. در مطالعه حاضر نقش مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT/mTOR در اثرات محافظتی سلژیلین متعاقب القای stroke در مدل حیوانی رت بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت این مسیر سیگنالینگ در مدل تجربی استروک کاهش پیدا کرده است که این تغییرات با اختلال حافظه رت ها همراه بود. متعاقب درمان با سلژیلین فعالیت مسیر سیگنالینگ فوق الذکر به طور معنی داری افزایش یافت که با بهبود حافظه رت ها همراه بود. اگر نتایج مطالعات بعدی نتایج حاصل از این مطالعه را تایید کند میتوان داروی سلژیلین را برای استفاده در بیماران مبتلا به سکته مغزی پیشنهاد داد. روش اجرای ایسکمی پس از القاء بیهوشی، ابتدا یک برش عمودی در ناحیه قدامی گردن حیوان ایجاد شود. با کنار زدن عضله جناغی -چنبری -پستانی، شریان های کاروتید مشترک در هر دو سمت در معرض دید قرار گرفت و پس از جدا کردن عصب واگ از آن، شریانها توسط کلامپ میکروسرجری به مدت ۲۵ دقیقه بسته شد. سپس کلامپها برداشته شد و گردش خون دوباره برقرار گردید. جهت تأیید مدل حیوانی مورد نظر، 24 ساعت پس از ایجاد ایسکمی، حداقل پنج حیوان از نظر بافت‌شناسی (H&E) و آزمون رفتاری بررسی شدند. گروههای مورد مطالعه شامل 4 گروه می باشند که عبارتند از 1، گروه کنترل نرمال: حیوانات در این گروه نه مورد جراحی قرار گرفتند نه دارو دریافت کردند. 2، گروه sham : حیوانات در این گروه جراحی نشدند و به مدت یک هفته سلژیلین با دوز 5mg/kg/ip دریافت کردند.. 3، گروه sham operated: در این گروه ایسکمی القا شد و حیوانات نرمال سالین دریافت کردند.. 4، گروه treatment: در این گروه ایسکمی القا شد و حیوانات به مدت یک هفته سلژیلین با دوز 5mg/kg/ip دریافت کردند. Real time-PCR یک هفته پس از درمان، تست رفتاری انجام شد و سپس حیوانات را با القای بیهوشی عمیق کشته و هیپوکامپ را جدا کرده و با روش Real time-PCR میزان بیان ژنهای مورد نظر در نمونه های هیپوکامپ بررسی شد. بر این اساس هیپوکامپ را بلا‌فاصله پس از جداسازی در نیتروژن مایع فریز کرده و لوله انجمادی حاوی هیپوکامپ را داخل فریزر 80- قرار داده تا فرا رسیدن زمان انجام آزمایش آسیب نبینند. بیان ژن‌های mTOR، IP3K،AKT و همچنین BDNF با روش Real time-PCR بررسی شد. داده‌های حاصل از Real-time RT-PCR با استفاده از فرمول PFAFFL محاسبه شد. ژن H2afz بعنوان نرمالایزر در نظر گرفته شد. ایمونوهیستوشیمی و بافت شناسی برای بررسی بافت‌شناسی از هیپوکامپ مقاطع بافتی تهیه شد و مطالعات ایمونوهیستوشیمی و بافت‌شناسی انجام شد. برای انجام ایمنوهیستوشیمی، نمونه‌های بافتی با آنتی‌بادی اولیه و سپس آنتی‌بادی ثانویه (که فلوئورسنس است) انکوبه شده و با میکروسکوپ فلوئوروسنس بررسی شد و میزان بیان mTOR، IP3K،AKT و همچنین BDNF مورد ارزیابی قرار گرفت. برای مطالعه بافت شناسی نمونه های بافتی جهت رنگ آمیزی با رنگ هماتوکسیلین و ایوزین (hematoxylin and eosin) اماده شدند و با استفاده از میکروسکوپ نوری تراکم نورونهای تاریک (dark neurons) در لایه سلولی هرمی در مناطقCA1 و CA3 و همچنین ضخامت ناحیه هرمی در مناطقCA1 و CA3 بررسی شد. ارزیابی یادگیری و حافظه فضایی: یک هفته پس از درمان حافظه فضایی حیوانات را مورد ارزیابی قراردادیم. دستگاه ماز آبی موریس به منظور ارزیابی یادگیری، حافظه و عملکرد حرکتی موش های صحرایی استفاده شد. .نتایج زیر حاصل شد: یک هفته درمان رت های ایسکمیک شده با داروی سلژیلین باعث بهبود وضعیت حافظه رت ها شد. از منظر تغییرات بافتی و سلولی نتایج نشان داد که درمان با سلژیلین باعث افزایش بیان ژن و پروتئین mTOR، IP3K،AKT و همچنین BDNF در نمونه های هیپوکامپ شد. همچنین مطالعه بافت شناسی نشان داد که سلژیلین درصد سلولهای مرده (نورون های تاریک) را در ناحیه هرمی هیپوکامپ به طور معنی داری کاهش داده است. روش اجرا برای بررسی بافت‌شناسی، فیکساسیون حیوانات با محلول فیکساتیو پارافرمالدیید 4 درصد حل شده در بافر فسفات 1/0مولار (4/7PH=) به روش پرفیوژن (Perfusion) انجام خواهد شد. پس از ثبوت و آماده سازی، مقاطع کورونال با استفاده از دستگاه میکروتوم روتاری تهیه و بر روی لام‌ها منتقل و مطالعات ایمونوهیستوشیمی و بافت‌شناسی انجام خواهد شد. برای انجام ایمنوهیستوشیمی، نمونه‌های بافتی با آنتی‌بادی اولیه و سپس آنتی‌بادی ثانویه (که فلوئورسنس است) انکوبه شده و با میکروسکوپ فلوئوروسنس بررسی خواهند شد و میزان بیان mTOR، IP3K،AKT و همچنین p-mTOR مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت. برای مطالعه بافت شناسی نمونه های بافتی جهت رنگ آمیزی با رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (hematoxylin and eosin) اماده میشوند و با استفاده از میکروسکوپ نوری تراکم نورونهای تاریک (dark neurons) در لایه سلولی هرمی در مناطقCA1 و CA3 و همچنین ضخامت ناحیه هرمی در مناطقCA1 و CA3 بررسی میشود. ارزیابی یادگیری و حافظه فضایی: یک هفته پس از درمان حافظه فضایی حیوانات را مورد ارزیابی قرار میدهیم. دستگاه ماز آبی موریس به منظور ارزیابی یادگیری، حافظه و عملکرد حرکتی موش های صحرایی استفاده خواهد شد. اجزای تشکیل دهنده این دستگاه شامل حوضچه آب با قطر 136 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتی متر که تا ارتفاع 25 سانتی متر با آب1 ±20 درجه سانتی گراد پر خواهد شد. یک سکوی گرد از جنس پلکسی گلاس به قطر 10 سانتی متر در مرکز ربع جنوب غربی و حدود 1 سانتی متر زیر آب قرار داده خواهد شد. منبع تولید نور مادون قرمز، دوربین مخصوص تصویر برداری و رایانه متصل به دوربین است. ماز در اتاقی که در اطراف آن علائم و نشانه های خارج مازی (مانند ساعت، پوستر، میز و...) وجود دارد، پروتکل های تمرینی گوناگون، شاخص های مختلفی اعم از یادگیری، حافظه و عملکرد حرکتی را می سنجد. تمام آزمون‌ها هر روز در یک ساعت مشخص انجام می‌گیرد. در هر کوشش به موش 60 ثانیه فرصت داده خواهد شد تا محل سکو را پیدا کند. در صورتی که موش سکو را پیدا نکند توسط محقق به سمت سکو هدایت خواهد شد. بین دو کوشش 30 ثانیه استراحت به موش داده خواهد شد تا در این فاصله محیط اطراف را بررسی کند. بین دو بلوک حدود 10 دقیقه از آب بیرون آورده خواهد شد و در قفس استراحت خواهد کرد عوامل سرعت حرکت و هماهنگی بینایی- حرکتی و یادگیری فضایی با استفاده از این دستگاه ارزیابی خواهد شد. هر موش به مدت چهار روز و هر روز در یک نوبت و در هر نوبت با چهار تجربه، مورد آموزش قرار خواهد گرفت. در طول چهار روز آموزش موش‌ها، محل سکو ثابت می‌ماند. در روز چهارم آزمون Vesible برای بررسی توانایی دیداری- حرکتی حیوانات خواهد شد. 3-3-6- معیارهای ورود و خروج سالم بودن رت ها از نظر وضعیت ظاهری وزن مناسب رت ها (بالای 2850 گرم) 3-3-7- روش تجزیه و تحلیل داده ها تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار SPSS استفاده و نتایج به صورت Mean±SEM نشان داده شدند. با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفهANOVA (One Way) و پست تست Tukey بررسی می شوند. نتایج به صورت میانگین و خطای معیار ارائه می گردد. معیار استنتاج آماری P<0/05 در نظر گرفته خواهد شد. یافته ها سلژیلین باعث بهبود وضعیت حافظه در رت های ایسکمیک شده شد آنالیز واریانس یکطرفه نشان داد که رت هایی که تحت ایسکمی قرار گرفته اند در روز 5 تست (پروب) مدت زمان کمتری در ناحیه 1 (Zone 1) نسبت به گروه کنترل سپری کرده اند (P<0.001) )شکل1A). درمان با سلژیلین به طور معنی داری مدت زمان سپری کردن در Zone 1 را نسبت به گروه دریافت کننده سالین افزایش داد (P<0.001) )شکل. (1A در مورد ارزیابی حافظه فضایی نتایج نشان داد که رت هایی که ایسکمیک شده اند مدت زمان بیشتری نیاز دارند تا سکوی مخفی را در تانک موریس پیدا کنند (شکل 1B). اختلاف معنی دار بین گروه ایسکمیک شده با گروه کنترل در روز های آموزش 1 و 3 (P<0.001) و در روزهای آموزش 2 و 4 (P<0.05) بود. درمان با سلژیلین مدت زمان یافتن سکوی پنهان را در رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری نسبت به رت های ایسکمیکی که سالین دریافت کرده بودند کاهش داد (P<0.05). درصد نورون های مرده (نورون های تاریک و آسیب دیده) در ناحیه هرمی هیپوکامپ مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2A). نتایج نشان داد که درصد سلول های مرده در هیپوکامپ رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری افزایش یافته است (P<0.001) و درمان با سلژیلین به طور معنی داری درصد سلولهای مرده در ناحیه هرمی را نسبت به گروه ایسکمیک دریافت کننده سالین به طور معنی داری کاهش داد (P<0.001). نتایج نشان داد که ضخامت ناحیه هرمی در هیپوکامپ رت های ایسکمیک کاهش معنی داری داشته (P<0.05) که متعاقب درمان با سلژیلین به طور معنی داری ضخامت ناحیه هرمی در مقایسه با گروه دریافت کننده سالین افزایش پیدا کرده بود (P<0.05). بحث و نتیجه گیری سلژیلین باعث بهبود وضعیت حافظه در رت های ایسکمیک شده شد آنالیز واریانس یکطرفه نشان داد که رت هایی که تحت ایسکمی قرار گرفته اند در روز 5 تست (پروب) مدت زمان کمتری در ناحیه 1 (Zone 1) نسبت به گروه کنترل سپری کرده اند (P<0.001) )شکل1A). درمان با سلژیلین به طور معنی داری مدت زمان سپری کردن در Zone 1 را نسبت به گروه دریافت کننده سالین افزایش داد (P<0.001) )شکل. (1A در مورد ارزیابی حافظه فضایی نتایج نشان داد که رت هایی که ایسکمیک شده اند مدت زمان بیشتری نیاز دارند تا سکوی مخفی را در تانک موریس پیدا کنند (شکل 1B). اختلاف معنی دار بین گروه ایسکمیک شده با گروه کنترل در روز های آموزش 1 و 3 (P<0.001) و در روزهای آموزش 2 و 4 (P<0.05) بود. درمان با سلژیلین مدت زمان یافتن سکوی پنهان را در رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری نسبت به رت های ایسکمیکی که سالین دریافت کرده بودند کاهش داد (P<0.05). درصد نورون های مرده (نورون های تاریک و آسیب دیده) در ناحیه هرمی هیپوکامپ مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2A). نتایج نشان داد که درصد سلول های مرده در هیپوکامپ رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری افزایش یافته است (P<0.001) و درمان با سلژیلین به طور معنی داری درصد سلولهای مرده در ناحیه هرمی را نسبت به گروه ایسکمیک دریافت کننده سالین به طور معنی داری کاهش داد (P<0.001). نتایج نشان داد که ضخامت ناحیه هرمی در هیپوکامپ رت های ایسکمیک کاهش معنی داری داشته (P<0.05) که متعاقب درمان با سلژیلین به طور معنی داری ضخامت ناحیه هرمی در مقایسه با گروه دریافت کننده سالین افزایش پیدا کرده بود (P<0.05).

خلاصه نتایج حاصله

آنالیز واریانس یکطرفه نشان داد که رت هایی که تحت ایسکمی قرار گرفته اند در روز 5 تست (پروب) مدت زمان کمتری در ناحیه 1 (Zone 1) نسبت به گروه کنترل سپری کرده اند (P<0.001) )شکل1A). درمان با سلژیلین به طور معنی داری مدت زمان سپری کردن در Zone 1 را نسبت به گروه دریافت کننده سالین افزایش داد (P<0.001) )شکل. (1A در مورد ارزیابی حافظه فضایی نتایج نشان داد که رت هایی که ایسکمیک شده اند مدت زمان بیشتری نیاز دارند تا سکوی مخفی را در تانک موریس پیدا کنند (شکل 1B). اختلاف معنی دار بین گروه ایسکمیک شده با گروه کنترل در روز های آموزش 1 و 3 (P<0.001) و در روزهای آموزش 2 و 4 (P<0.05) بود. درمان با سلژیلین مدت زمان یافتن سکوی پنهان را در رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری نسبت به رت های ایسکمیکی که سالین دریافت کرده بودند کاهش داد (P<0.05). درصد نورون های مرده (نورون های تاریک و آسیب دیده) در ناحیه هرمی هیپوکامپ مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2A). نتایج نشان داد که درصد سلول های مرده در هیپوکامپ رت های ایسکمیک شده به طور معنی داری افزایش یافته است (P<0.001) و درمان با سلژیلین به طور معنی داری درصد سلولهای مرده در ناحیه هرمی را نسبت به گروه ایسکمیک دریافت کننده سالین به طور معنی داری کاهش داد (P<0.001). نتایج نشان داد که ضخامت ناحیه هرمی در هیپوکامپ رت های ایسکمیک کاهش معنی داری داشته (P<0.05) که متعاقب درمان با سلژیلین به طور معنی داری ضخامت ناحیه هرمی در مقایسه با گروه دریافت کننده سالین افزایش پیدا کرده بود (P<0.05).

فایل های پژوهش