پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

سرطان پستان بعد از سرطان ریه، دارای بیشترین میزان شیوع بین انواع سرطان ها با میزان 7/1 میلیون مورد (9/11 درصد) در جهان می باشد. در جمعیت زنان جهان، سرطان پستان بالاترین میزان شیوع (5/25 %) و بالاترین میزان مرگ و میر را در بین همه ی سرطان ها ایجاد میکند. RNA های غیرکد شونده بلند عضو مهمی از رونوشت های غیرکدشونده هستند، ارتباط RNAهای غیرکدشونده ی طویل (LncRNAs) با پروسه های فیزیولوژیک و پاتوژنز در سرطان های گوناگون ازجمله سرطان پستان به طور روزافزون در حال شناسایی است. به دلیل ارتباط مستقیم و گسترده ی این دسته از RNA ها با تنظیمات چرخه سلولی و نقش مهمی که در تغییر رفتار سلول دارند، بررسی تغییرات این ژنها می تواند باعث درک بهتر و دقیق تری از فرآیند های ایجاد سرطان شود. همچنین می توان از این ژن ها به عنوان مارکر های مناسب برای تشخیص بیماری، طبقه بندی زیرگروه های سرطان پستان و همچنین تعیین پیش آگهی بیمار استفاده کرد. روش اجرا . نوع پژوهش این مطالعه به صورت مورد-شاهدی (case-control) و علوم پایه (experimental) انجام شده است. 3-3-2. مکان و زمان پژوهش این مطالعه طی سال 96-97 در شهر شهرکرد صورت گرفت. 3-3-3. ابزار و روش جمع آوری داده ها پس از انتخاب افراد هر دو گروه تست و کنترل، ارائه توضیحات لازم برای آنها و اخذ رضایت کتبی، نمونه گیری از خون وریدی انجام شد . 3-3-4. معیارهای ورود به مطالعه افراد دارای سرطان پستان مراجعه کننده به بیمارستان های سینا و فرمانیه تهران در سال 1397 که وجود این بیماری در آنها توسط نتایج پاتولوژی بررسی شد. 3-3-5. حجم نمونه و محاسبه آن برای تعیین تعداد نمونه با استفاده از رابطه حجم نمونه در دو گروه به صورت زیر محاسبه شد : با در نظر گرفتن خطای نوع اول 5 درصد و توان 80 درصد تعداد نمونه لازم در هر گروه برای بررسی بیان برابر 50 تعیین گردید. لذا 50 فرد اسکیزوفرنی از دپارتمان روانشناسی دانشگاه علوم پزشکی همدان و 50 فرد سالم که از لحاظ سنی و جنسیت با گروه اول همسان بودند در این مطالعه شرکت کردند. در انتها کلیه نتایج، توسط مشاور آماری طرح با کمک Linreg و نرم افزار SPSS نسخه 16 و آزمون t- استیودنت مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفتند. همچنین سطح معنی داری آزمونها 5 درصد در نظر گرفته شد. 3-3-6. گردآوری داده ها پس از اطلاع رسانی کامل در خصوص طرح تحقیقاتی و پرسشنامه توسط مجریان طرح به بیماران و اخذ رضایت کتبی از بیماران و گروه شاهد، نمونه گیری از خون وریدی بازو انجام شد. 3-3-6-1. آزمایشات مولکولی جهت ارزیابی بیان 54 فرد دارای سرطان پستان و همچنین 54 فرد سالم همسان سازی شده از نظر جنسیت و سن با گروه بیمار، به طور تصادفی انتخاب شدند و پس از توضیح هدف تحقیق و جلب مشارکت آنها، یک روز تعیین گردید تا به مرکز مورد نظر مراجعه نمایند و سپس از آنها 5 ml خون وریدی گرفته شد و در لوله حاوی EDTA در یخچال نگهداری شد و در همان روز استخراج RNA انجام گرفت. 3-3-6-1-1. استخراج RNA در این مرحله، جهت بررسی میزان تغییر در بیان ژن مورد نظر، RNA کل از سلول های سفید خون استخراج گردید.: کیت استخراج RNA (GeneAll Hybrid-RTM Blood RNA) 3-3-6-1-2. تعیین میزان RNA بدست آمده در این مرحله جهت اندازگیری میزان RNA استخراج شده RNA به نسبت 1 به 50 در آب مقطر حل شده و توسط دستگاه بیوفتومتر میزان جذب نوری در nm 260 اندازه گیری شد و با توجه به این مطلب که 1= 260 OD معادل μl 40 از RNA در یک میلی لیتر است، با استفاده از فرمول زیر غلظت RNA محاسبه گردید. Concentration = 40× OD260 × 1/dilution factor 3-3-6-1-4. سنتز cDNA تبدیل RNA به cDNA برای انجام RT-PCR صورت می گیرد. الگوی اولیه در RT-PCR مولکول RNA تک زنجیره ای است. مواد مورد نیاز : کیت سنتز cDNA (Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit) ( Lot 00244639) جدول 3-4 : مراحل واکنش Revers Transcription Step 4 Step 3 Step 2 Step 1 (° C) 5 70 25 42 Temperature For ever 5 5 60 Time جدول3-5: مواد واکنش RT-PCR In 25μl Tube Component 7 μl Master mix 10X 12 μl cDNA 1 μl Forward Primer 1μl Reverse Primer 4 μl D.D.Water 25 μl Total volume واکنش RT-PCR در دستگاه ترموسایکلر طبق جدول زیر تنظیم گردید. جدول 3-6: مراحل واکنش RT-PCR Number of Cycles Time Temperature °C Process 10 min 95 Initial Denaturation 30s 95 Denaturation 30 45s 63 Annealing 30s 75 Extension 10 min 75 Final Elongation 3-3-6-1-5. سنجش کمی بیان ژن ها با استفاده از qRT-PCR 3-3-7. روش TaqMan Probe : اساس این روش خاصیت 5′ Exonuclease Activity آنزیم Taq DNA polymeraseمی باشد. شکل 3-1: آنزیم Taq DNA Polymerase با استفاده از خاصیت 5′ Exonuclease Activity خود پروب را تجزیه می کند. این خاصیت اساس کار Taq man probs است. شکل 3-2 : چگونگی عملکرد پروب TaqMan نشان داده شده است. آنزیم پس از نزدیک شدن به پروب با استفاده از خاصیت 5′ Exonuclease Activity آن را تجزیه می کند. وقتی پروب تجزیه شد ماده Reporter از تأثیر Quencher خارج شده و از خود فلورسانس ساطع می کند. 3-3-7-1. طراحی پرایمر جهت واکنش qRT-PCR : جدول 3-7 : توالی پرامر وپروب ژن رفرنس و هدف Product size توالی ژن 88 Primer forward: AGTCTGGCTTATATCCAACACTTC Primer reverse: CACAGAACTAGAACATTGATA FAM -CATCTGGAGTCCTATTGACATCGC- TAMRA HPRT1 79 Primer forward: CCAAGACGACTGTTACAA Primer reverse: GAAGCCCTCCATGATAAC FAM-TTGCCATCTCACAGTCATCCAC-TAMRA BACE1 113 Primer forward: GACACTGTACCATCTCTTTTACCC Primer reverse: CACCACCAACCTTCGTTTGC FAM - AGTCCACTCACGGAGGAGGTCGCC -TAMRA BACE1-AS 104 Primer forward: AGATGAGTATGCCTGCCGTG Primer reverse: CGGCATCTTCAAACCTCCA B2M 96 Primer forward: GGCAAGGCTATGTGATTACAAGG Primer reverse: CATCAAGTGAAATAAACACACAACCC IFNG 94 Primer forward: AGGAAGCTGGGTAATTGAATGC Primer reverse: CTTAGGAGGAGAATTTTGGGAGAG IFNG-AS1 111 Primer forward GGAGTATGGAGCAGTCACTTACAG Primer reverse: AGCAGCGGCACGGAAGAG FAM- ACATCATCCGGGTTCTCCGCGCCT -TAMRA PINK1 165 Primer forward GGTCCACGCCTTCCAGCAG Primer reverse: TTCCTCGCATCTCCTGTTCCTG FAM- CCGCCTCGCCGCCATGATGCTG -TAMRA PINK1-AS 3-3-7-2. شرایط واکنش qRT-PCR دستگاه مورد استفاده (Rotorgene-6000) Corbett بود. میزان مواد مورد استفاده برای یک تیوب 200 مایکرولیتری در واکنش به شرح زیر می باشد: جدول3-8 مواد مورد نیاز برای واکنش qRT-PCR In 200μl Tube Component 10 Maxima TaqMan 3.5 Water , nuclease-free 0.5 Probe ( 10p mol/ μl ) 1 Primer F 1 Primer R 4 cDNA 20 Total volume جدول 3-9: مراحل واکنش Real-time PCR Number of cycles Time Temprature°C Steps 1 5(min) 95 Polymerase activation 40 15(s) 95 Denaturation 1(min) 60 Annealing/Extension 3-3-7-3. آنالیز داده های qRT-PCR برای آنالیز داده های Real-time PCRاز دو نرم افزار LinReg و REST استفاده شد که مختصری در مورد هر دو توضیح داده می شود. 3-3-7-3-1. استفاده از نرم افزار LinReg جهت تعیین Ct و کارایی واکنش 3-3-7-3-2. استفاده از نرم افزار REST جهت مقایسه تغییرات بیان ژن های مذکور در گروه های مورد مطالعه : یافته ها -4. یافته ها 3-4-1. ویژگی های کلینیکی و قومیتی بیماران جدول 3-10 ویژگی های کلینیکی و قومیتی بیماران را نشان می دهد. جدول 3-10. اطلاعات کلی بیماران متغیرها مقادیر سن (years) (mean±SD) 51.79 ± 13.54 (29-81) Menarche age (years) (mean±SD) 13 ± 1.65 (10-18) Menopause age (years) (mean±SD) 44.91 ± 14.91 (38-60) سن اولین حاملگی (years) (mean±SD) 18.04 ± 8.36 (14-32) مدت زمان شیردهی (months) (mean±SD) 41.62 ± 34.1 (3-120) نتیجه مثبت خانوادگی برای دیگر سرطان ها (%) 17% مرحله سرطان (%) I 30.8 II 28.8 III 30.8 IV 9.6 Overall grade (%) I 17 II 49 III 34 Mitotic rate (%) I 45.2 II 42.9 III 11.9 اندازه تومور (%) <2 cm 32 >=2 cm, <5cm 66 >=5 cm 2 گیرنده استروژن (%) مثبت 87.8 منفی 12.2 گیرنده پروژسترون (%) مثبت 77.1 منفی 22.9 Her2/neu expression (%) مثبت 25 منفی 75 Ki67 expression (%) مثبت 100 منفی 0 3-4-2. بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت توموری در مقایسه با ANCTs BACE1 به صورت معناداری در بافت توموری در مقایسه با ANCTs تنظیم منفی شده است. با این حال، BACE1-AS تفاوت معناداری میان بافت های توموری و ANCTs نداشت (شکل 3-3). شکل 3-3. بیان نسبی BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری و ANCTs نتایج Bayesian t-test برای مقایسه بیان نسبی ژن های BACE1 و BACE1-As میان بافت های توموری و ANCTs در جدول 3-11 نشان داده شده است. جدول 3-11. T-test برای مقایسه بیان نسبی ژن ها میان گروه های دو تایی 95% HDI P-value Effect Size SD تفاوت بیان نسبی Posterior mean ژن ANCTs بافت های توموری [-2.58, -0.71] 0.001 -0.487 0.48 -1.637 1.02±0.67 -0.44±0.68 BACE1 [-1.37, 0.62] 0.499 0.094 0.51 -0.3562 0.63±0.5 0.42±0.43 BACE1-AS 3-4-3. همراهی میان سطوح بیان ژن ها و اطلاعات کلینیکی بیماران ما همراهی میان سطوح بیان ژن ها و مرحله سرطان را توسط مدل Bayesian Multilevel بعد از تعدیل اثرات سن ارزیابی کردیم و تفاوت معناداری در بیان BACE1 میان مراحل یک و دو سرطان یافتیم (جدول 3-12). با این حال، میزان بیان BACE1-AS میان مراحل مختلف سرطان تفاوت معناداری نداشت (جدول 3-13). جدول 3-12. نتایج Bayesian Multilevel، همراهی میان میزان بیان BACE1 و مراحل سرطان بعد از تعدیل اثرات سن 95% Credible Interval P-Value SE Estimate بیان BACE1 [0.65, 4.28] 0.035 1.25 1.81 Stage 2 [-2.14, 2.96] 0.141 1.28 0.38 Stage 3 [-3.68, 3.24] 0.8 1.77 -0.29 Stage 4 [-0.11, 0.04] 0.272 0.04 -0.03 Age جدول 3-13. نتایج Bayesian Multilevel، همراهی میان میزان بیان BACE1-AS و مراحل سرطان بعد از تعدیل اثرات سن 95% Credible Interval P-Value SE Estimate بیان BACE1-AS [-2.43, 3.34] 0.347 1.47 0.46 Stage 2 [-2.43, 3.17] 0.543 1.42 0.33 Stage 3 [-6.28, 2.04] 0.482 2.1 -2.14 Stage 4 [-0.15, 0.03] 0.248 0.05 -0.06 Age ما همچنین ارتباط میان سطوح ژن ها را در هر یک از گروه های نمونه ها و سن بیماران ارزیابی کردیم. میزان بیان BACE1 و BACE1-AS با سن بیماران در هیچ کدام از زیرگروه ها ارتباط نداشت (جدول 3-14). جدول 3-14. ارتباط میان میزان بیان ژن ها در هرکدام از زیرگروه های سنی بیماران BACE1-AS BACE1 0.059 -0.252 بافت های توموری گروه ها 0.107 -0.164 ANCTs ما همچنین همراهی بیان نسبی این ژن ها و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی را ارزیابی کردیم (جدول 3-15). میزان بیان ژن BACE1-AS در نمونه های ER مثبت در مقایسه با نمونه های ER منفی به صورت معناداری بیشتر بود (P=0.01). تفاوت معناداری میان میزان بیان ژن ها در زیرگروه های بیماران متفاوت یافت نشد. جدول 3-15. همراهی میان سطوح رونوشت ژن های مذکور در بافت های توموری و ویژگی های تومور P-Value BACE1-AS P-Value BACE1 سن 0.78 327.39 (1.54) vs. 489.87 (2.15) 0.35 3.06 (1.42) vs. 91.45 (288.38) <55 years old vs. ≥55 years old ER Status 0.09 63.68 (304.84) vs. 809.02 (2.66) 0.08 2.39 (1.26) vs. 484.36 (1.17) ER(+) vs. ER(-) PR Status 0.09 63.68 (304.84) vs. 809.02 (2.66) 0.08 571 (2.98) vs. 7.699 (2.45) PR(+) vs. PR(-) HER2 Status 0.47 1.73 (1.97) vs. 312.08 (1.49) 0.12 6.81 (2.36) vs. 666.5 (3.04) HER2 (+) vs. HER2 (-) Tumor Grade 0.95 56.93 (45.06) vs. 1.4 (1.84) 0.9 336.89 (419.44) vs. 10.6 (37.95) Grade 1 vs. 2 0.28 56.93 (45.06) vs. 1.27 (3.14) 0.47 336.89 (419.44) vs. 6.42 (2.05) Grade 1 vs. 3 0.09 1.4 (1.84) vs. 1.27 (3.14) 0.24 10.6 (37.95) vs. 6.42 (2.05) Grade 2 vs. 3 3-4-4. همراهی میان میزان بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری و ANCTs ارتباط معناداری میان میزان بیان این ژن ها و بافت های توموری و همچنین ANCTs یافت شد (شکل 3-4 A و B). شکل 3-4. همراهی میان میزان بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری (A) و ANCTs (B) 3-4-5. بیان نسبی IFNG و IFNG-AS1 در بافت سرطان سینه در مقایسه با ANCTs IFNG-AS1 در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs به صورت معنادری تنظیم مثبت شده بود (Expression ratio=2.23, P=0.03). اگرچه میزان بیان IFNG در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs بیشتر بود (بیان نسبی= 1.89)، ولی به سطح معناداری نرسیده بود (P=0.07). شکل 3-5 معیار CT را در بافت های توموری و ANCTs نشان می دهد. شکل 3-5. بیان نسبی IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCTs 3-4-6. همراهی میان سطوح رونوشت های IFNG و IFNG-AS1 و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران مامیزان بیان IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCT مقایسه کردیم و بیماران را بر اساس این معیارها به گروه های تنظیم مثبت و منفی طبقه بندی کردیم. IFNG و IFNG-AS1 به ترتیب در بافت های توموری بدست آمده از 35 فرد و 37 فرد تنظیم مثبت شده بودند. متعاقبا، ما همراهی میان اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی و بیان نسبی ژن های IFNG و IFNG-AS1 را ارزیابی کردیم. همراهی معناداری میان اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران و تغییرات بیان این ژن ها در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs یافت نشد. جدول 3-16 نتایج آنالیز همراهی میان بیان نسبی این ژن ها در بافت توموری در مقایسه با ANCTs و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی را نشان می دهد. جدول 3-16. نتایج آنالیز همراهی میان بیان نسبی ژن های مذکور در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران IFNG Up-regulation IFNG Down-regulation P value IFNG-AS1 Up-regulation IFNG-AS1 Down-regulation P value سن 0.57 0.3 <55 years 23 (67.6%) 11 (32.4%) 25 (73.5%) 9 (26.5%) ≥55 years 12 (60%) 8 (40%) 12 (60%) 8 (40%) Stage 0.95 0.25 1 9 (56.3%) 7 (43.7%) 10 (62.5%) 6 (37.5%) 2 10 (66.7%) 5 (33.3%) 9 (60%) 6 (40%) 3 11 (68.8%) 5 (31.2%) 14 (87.5%) 2 (12.5%) 4 4 (80%) 1 (20%) 3 (20%) 2 (80%) Histological Grade 0.87 0.91 1 5 (62.5%) 3 (37.5%) 6 (75%) 2 (25%) 2 16 (69.6%) 7 (30.4%) 15 (62.5%) 8 (34.8%) 3 10 (62.5%) 6 (37.5%) 12 (75%) 4 (25%) Mitotic Rate 0.9 0.64 1 13 (68.4%) 6 (31.6%) 14 (73.7%) 5 (26.3%) 2 11 (61.1%) 7 (38.9%) 11 (61.1%) 7 (38.9%) 3 3 (60%) 2 (40%) 4 (80%) 1 (20%) اندازه تومور 0.7 0.67 <2 9 (56.3%) 7 (43.7%) 12 (75%) 4 (25%) 2-5 22 (66.7%) 11 (33.3%) 21 (63.6%) 12 (36.4%) >5 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) ER Status 0.08 0.65 مثبت 26 (60.5%) 17 (39.5%) 29 (67.4%) 14 (32.6%) منفی 6 (100%) 0 (0%) 5 (16.7%) 1 (83.3%) PR Status 0.07 0.46 مثبت 22 (59.5%) 15 (40.5%) 25 (67.6%) 12 (32.4%) منفی 10 (90.9%) 1 (9.1%) 9 (81.8%) 2 (18.2%) Her2 Status 0.48 0.27 مثبت 7(58.3%) 5(41.7%) 7 (58.3%) 5 (41.7%) منفی 25(69.4%) 11(30.6%) 27 (75%) 9 (25%) در مرحله بعد بیان نسبی هر یک از ژن ها در نمونه های توموری میان زیرگروه ها بر اساس اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی مقایسه شد (جدول 3-17). میزان بیان IFNG در بافت های توموری HER2 منفی در مقایسه با HER2 مثبت (P=0.01)و نمونه های درجه یک در مقایسه با درجه دو به صورت معناداری بیشتر بود (P=0.03). تفاوت معنادار دیگری در بیان این ژن ها میان گروه های دیگر یافت نشد. جدول 3-17. مقایسه سطوح بیان ژن های IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری سرطان سینه بیماران و خصوصیات کلینیکی پاتولوژیکی IFNG P value IFNG-AS1 P value سن <55 years vs. ≥55 years 0.03 (0.05) vs. 0.01 (0.02) 0.09 0.015 (0.02) vs. 0.006 (0.008) 0.07 ER Status ER(+) vs. ER(-) 0.03 (0.05) vs. 0.02 (0.01) 0.66 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.97 PR Status PR(+) vs. PR(-) 0.03 (0.05) vs. 0.02 (0.02) 0.74 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.92 HER2 Status HER2 (+) vs. HER2 (-) 0.009 (0.01) vs. 0.03 (0.05) 0.01 0.01 (0.01) vs. 0.01 (0.02) 0.57 Tumor Grade Grade 1 vs. 2 0.06 (0.08) vs. 0.01 (0.03) 0.03 0.02 (0.02) vs. 0.01 (0.02) 0.73 Grade 1 vs. 3 0.06 (0.08) vs. 0.02 (0.02) 0.1 0.02 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.69 Grade 2 vs. 3 0.01 (0.03) vs. 0.02 (0.02) 0.89 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.99 3-4-7. همراهی میان سطوح رونوشت های IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCTs ارزیابی همراهی میان میزان بیان ژن های IFNG و IFNG-AS1 ارتباط قوی میان سطح بیان آن ها در بافت های توموری و ANCTs نشان داد (شکل 3-6 A و B). A B شکل 3-6. همراهی میان میزان بیان IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری (A) و ANCTs (B) 3-4-8. آنالیز منحنی ROC براساس نتایج منحنی ROC IFNG و IFNG-AS1 برای شناسایی وضعیت بیماری به ترتیب 3/83 % اختصاصیت و 2/85 % حساسیت میزان بیان داشت. نتایج آنالیز منحنی ROC در شکل 3-7 و جدول 3-18 نشان داده شده است. شکل 3-7. منحنی ROC برای پیش بینی وضعیت بیماری براساس سطوح بیان IFNG و IFNG-AS1 جدول 3-18. نتایج آنالیز منحنی ROC Estimate criterion AUC J حساسیت اختصاصیت P-value IFNG > 0.007 0.664 0.37 53.7 83.3 0.002 IFNG-AS1 >0.0001 0.665 0.25 85.2 40.7 0.001 ترکیبی از هر دو ژن >0.47 0.665 0.33 61.1 72.2 0.001 3-4-9. بیان نسبی PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه در مقایسه با ANCTs میزان بیان PINK1 در نمونه های توموری در مقایسه با ANCTs به صورت معناداری کمتر بود (Fold change=0.19, P=0.003). با این حال، میزان بیان PINK-AS1 میان بافت های توموری و ANCTs تفاوت نداشت (Fold change=0.64, P=0.36). شکل 3-8 بیان نسبی این ژن ها را در بافت های توموری و ANCTs نشان می دهد. شکل 3-8. بیان نسبی در بافت های توموری و ANCTs 3-4-10. همراهی میان بیان ژن ها و ویژگی های تومور ما بیان نسبی ژن ها را در نمونه های توموری در مقایسه با ANCT ارزیابی کردیم و بیماران را برای هر یک از ژن ها بر اساس معیارهایشان به گروه های تنظیم مثبت و منفی طبقه بندی کردیم. ما متعاقبا همراهی میان بیان نسبی ژن ها و ویژگی های تومور را ارزیابی کردیم (جدول 3-19). جدول 3-19. همراهی میان بیان نسبی ژن ها در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs و ویژگی های تومور PINK1 up-regulation PINK1 down-regulation P value PINK1-AS1 up-regulation PINK1-AS1 down-regulation P value سن 0.56 0.72 <55 years 11 (32.4%) 23 (67.6%) 12 (35.3%) 22 (64.7%) ≥55 years 5 (25%) 15 (75%) 8 (40%) 12 (60%) Stage 0.07 0.6 1 4 (25%) 12 (75%) 5 (31.3%) 11 (68.7%) 2 3 (20%) 12 (80%) 4 (26.7%) 11 (73.3%) 3 3 (18.8%) 13 (81.2%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) 4 4 (80%) 1(20%) 3 (60%) 2 (40%) Histological grade 0.1 0.92 1 2 (25%) 6 (75%) 2 (25%) 6 (75%) 2 3 (13%) 20 (87%) 8 (34.8%) 15 (65.2%) 3 7 (43.8%) 9 (56.3%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) Mitotic rate 0.03 0.64 1 2 (10.5%) 17 (89.5%) 6 (31.6%) 13 (68.4%) 2 6 (33.3%) 12 (66.7%) 7 (38.9%) 11 (61.1%) 3 3 (60%) 2 (40%) 2 (40%) 3 (60%) Tumor size 0.4 0.58 <2 4 (25%) 12 (75%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) 2-5 9 (27.3%) 24 (72.7%) 11 (33.3%) 22 (66.7%) >5 1 (100%) 0 (0%) 1(100%) 0 (0%) ER status 0.33 0.65 Positive 11 (25.6%) 32 (74.4%) 15 (34.9%) 28 (65.1%) Negative 3 (50%) 3 (50%) 3 (50%) 3 (50%) PR status 0.11 0.46 Positive 8 (21.6%) 29 (78.4%) 11 (29.7%) 26 (70.3%) Negative 5 (45.5%) 6 (54.5%) 6 (54.5%) 5 (45.5%) Her2 status 0.71 0.6 Positive 4 (33.3%) 8 (66.7%) 5 (41.7%) 7 (58.3%) Negative 9 (25%) 27 (75%) 12 (33.3%) 24 (66.7%) ما همچنین میزان بیان PINK1 و PINK1-AS را میان زیرگروه ها بر اساس ویژگی های کلینیکی پاتولوژیکی تومورها مقایسه کردیم و تمایل به سوی بیان بیش از حد PINK1 در بیماران جوان تر در مقایسه با پیرتر (P=0.09) و تومورهای درجه دو در مقایسه با درجه سه (P=0.08) یافتیم (جدول 3-20). جدول 3-20. همراهی میان سطوح رونوشت ژن ها در بافت های توموری و ویژگی های توموری PINK1 expression P value PINK1-AS1 expression P value سن <55 years old vs. ≥55 years old 7.12 (2.56) vs. 6.21 (1.81) 0.09 3406.35 (86.84.56) vs. 7424.23 (21455.68) 0.34 ER Status ER(+) vs. ER(-) 4.19 (2.11) vs. 1.03 (2.52) 0.51 4166.08 (13378.33) vs. 2086.09 (2719.47) 0.73 PR Status PR(+) vs. PR(-) 3.66 (2.17) vs. 9.73 (2.19) 0.42 2632.01 (8284.69) vs. 1726.18 (2373.62) 0.73 HER2 status HER2 (+) vs. HER2 (-) 3.8 (1.29) vs. 5.47 (2.4) 0.82 830.67 (1894.92) vs. 3001.36 (8489.03) 0.38 Tumor Grade Grade 1 vs. 2 2.05 (3.05) vs. 4.23 (1.25) 0.9 9503.13 (16191.96) vs. 1128.86 (2255.95) 0.21 Grade 1 vs. 3 2.05 (3.05) vs. 1.49 (3.63) 0.25 9503.13 (16191.96) vs. 5371.4 (17653.05) 0. 71 Grade 2 vs. 3 4.23 (1.25) vs. 1.49 (3.63) 0.08 1128.86 (2255.95) vs. 5371.4 (17653.05) 0.55 3-4-11. ارتباط بین میزان بیان PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه و ANCTs ما ارتباط معناداری میان بیان نسبی این ژن ها در بافت های توموری و ANCTs یافتیم (شکل 3-9 و شکل 3-10). بر اساس معیار R2 محاسبه شده، همراهی در بافت های توموری قوی (R2=0.89) و در ANCTs متوسط بود (R2=0.35). شکل 3-9. ارتباط بیان میان PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه شکل 3-10. ارتباط میان بیان PINK1 و PINK1-AS در ANCTs 3-4-12. آنالیز نمودار ROC آنالیز منحنی ROC برای سطح رونوشت PINK1 در تشخیص سرطان سینه اختصاصیت 6/79% و حساسیت 9/51% نشان داد (شکل 3-11 و جدول 3-21). شکل 3-11. نتایج آنالیز نمودار ROC برای ارزیابی قدرت PINK1 جدول 3-21. نتایج آنالیز نمودار ROC Estimate criterion AUC J حساسیت اختصاصیت P-value PINK1 transcript levels > - 9.81 0.62 0.31 51.9 79.6 0.02 بحث و نتیجه گیری در این مطالعه ما میزان بیان BACE1 و BACE1-AS در سرطان سینه ارزیابی کردیم و تنظیم منفی BACE1 را در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs گزارش کردیم. BACE1 تولید App را در مرحله اول کاتالیز می کند (9)، که میزانش در برخی بدخیمی های انسانی زیاد شده و تکثیر سلولی را افزایش می دهد (10). در لاین های سلولی سرطان سینه، میزان بیان mRNA APP توسط دهیدراسیون تستسترون دچار تنظیم مثبت شده و بیانش با فعالیت تکثیر سلولی همراهی دارد. علاوه بر این، بیان پروتئین APP به عنوان یک فاکتور پیش آگهی دهنده در بیماران سرطان سینه ER مثبت است (11). به علاوه، سطوح افزایش یافته APP نشان داده شده است که تومورزایی و تهاجم سلول های سرطان سینه بدخیم را افزایش می دهد (12). با این حال، فعالیت و بیان BACE1 هنوز در نمونه های سرطان سینه بررسی نشده است. برخی از تحقیقات بر نقش BACE1 در پاتولوژی دیگر سرطان ها تاکید می کند. مهار کننده های BACE1 به عنوان نوعی عوامل درمانی در برخی از بدخیمی های انسان معرفی شده اند از آنجایی که آن ها می توانند رشد و رگزایی گلیوبلاستوما و تومورهای آدنوما ریه را در مدل حیوانی سرکوب کنند (13). BACE1 همچنین در شکاف photolytic گیرنده انسولین در گیر است. قطعه حل شدنی IR توسط این فعالیت آنزیمی تولید شده است که در پلاسمای بیماران سرطان کبد افزایش یافته است (14). متعاقبا، نتایج این مطالعه الگوی متفاوت بیانی BACE1 را در بافت های سرطان سینه در مقایسه با دیگر بدخیمی ها نشان داد. توضیح احتمالی چنین اختلافاتی، وجود یک عملکرد مختص بافت برای BACE1 است. از سوی دیگر، همانطور که مطالعات سابق نشان داده است که APP در بافت های سرطان سینه دچار تنظیم مثبت شده است، ما فرض کردیم که تنظیم منفی مشاهده شده BACE1 در مطالعات ما ممکن است توسط فعال شدن یا بیان بیش از حد گاما-سکرتاز برای انجام مرحله نهایی تولید جبران شده باشد. آنالیز همزمان سطوح BACE، گاما سکرتاز و APP در نمونه های بیشتر بیماران سرطان سینه می تواند نقش این پروتئین ها را در پاتوژنز سرطان سینه شفاف سازی کند. سطوح مشابه BACE1-AS در بافت های توموری و ANCTs برخلاف تنظیم منفی BACE1 در بافت های توموری ممکن است دلالت بر نقص در تنظیم بیان BACE1-AS داشته باشد. احتمال بعدی نیز در مشاهدات ارتباط قوی میان این دو رونوشت در ANCTs در مقایسه با بافت های توموری منعکس شده است. مطالعات آینده برای ارزیابی میانکنش بین این دو رونوشت در بافت های سرطانی و طبیعی لازم است. نتایج مدل Bayesian Multilevel تفاوت معناداری را در میزان بیان BACE1 میان مرحله اول و دوم سرطان بعد از تعدیل اثرات سن نشان داده است. چنین یافته ای ممکن است بر اثر مختص مرحله این LncRNA یا دخالتش در مراحل توسعه سرطان دلالت کند که باید در تعداد بیشتر بیماران بررسی شود. ما ارتباطی میان سطوح رونوشت های این ژن ها در بافت سرطان سینه و سن بیماران نیافتیم. مطالعات سابق بر روی حیوانات تمایز بیانی واریانت های BACE وابسته به سن را در بافت مغز نشان داده است (15). مدارک بیشتری برای تنظیم وابسته به سن BACE1 در مغز توسط مشاهدات تنظیم منفی miR-186 به عنوان یک تنظیم کننده منفی BACE1 در مغزهای مسن فراهم شده است (16). چنین تضادهایی ممکن است به دلیل حضور مکانیسم تنظیمی بیان BACE1 باشد. در نهایت ما بیان بیشتر BACE1-AS را در نمونه های ER مثبت در مقایسه با نمونه های ER منفی یافتیم. مطالعات سابق همراهی میان فعالیت BACE1 و کاهش استروزن مغز در بیماران زن AD و مدل حیوانی نشان داده است (17). به علاوه، درمان توسط استروژن شدیدا سطوح پروتئین BACE1 را در مسیر وابسته به ER کاهش داده است (18). همراهی مشاهده شده میان میزان بیان BACE1-AS و وضعیت ER یک سطح اضافی پیچیدگی در تنظیم بیان BACE توسط استروژن را پیشنهاد می کند. در نتیجه، ما تنظیم منفی BACE1 را در نمونه های سرطان سینه در ارتباط با اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران نشان دادیم. مطالعات آینده برای ارزیابی نقش BACE1 در پاتوژنز سرطان سینه لازم است. علاوه بر این، در این مطالعه ما سطوح رونوشت IFNG و IFNG-AS1 را در بافت های سرطان سینه و ANCTs اندازه گیری کردیم و تنظیم مثبت معناداری برای IFNG-AS1 در بافت های توموری یافتیم. سابقا نشان داده شده است که IFNG-AS1 میزان بیان IFNG را در هر دو سطح رونویسی و ترجمه در سلول های T CD4+ تنظیم می کند (19). همچنین، ارتباط مثبتی میان سطوح رونوشت این دو ژن و بافت های تیروئیدی از بیماران HT شناسایی شده است (19). نتایج ما الگوی مشابهی از ارتباط میان سطوح رونوشت این ژن ها در نمونه های توموری و ANCTs آشکار کرده است. ما تفاوت معناداری در میزان بیان IFNG میان بافت های توموری و ANCTs پیدا نکردیم. García-Tuñón و همکاران میزان بیان IFNG را در ضایعات فیبروکیستیک، تومورهای موضعی و تومورهای نفوذی پستان مورد بررسی قرار دادند و بیان بالاتر IFNG در کارسینوم نسبت به تومورهای خوش خیم و نفوذ کننده یافتند. آن ها IFNG را به عنوان یک معیار در درمان سرطان پستان غرض کردند (20). در تطابق با این مشاهدات ما سطوح بالاتری از IFNG در نمونه های درجه یک در مقایسه با درجه دو یافتیم. این احتمال وجود دارد که سلول های توموری بیان IFNG را به عنوان یک مکانیسم برای فرار از سیستم ایمنی دچار تنظیم منفی کند. ما همچنین میزان بیان بالاتری از IFNG را در بافت های توموری HER2 منفی در مقایسه با HER2 مثبت یافتیم. سابقا نشان داده شده است که IFNG میزان بیان HER2 در سلول های سرطان پروستات تنظیم منفی می کند (21). وجود مکانیسم های مشابه در سلول های سرطان سینه لازم است که بررسی گردد. با این حال،همانطور که توسط Nagai و همکاران گزارش شده است تاثیر IFNG بر روی سلول های سرطان سینه HER2 مثبت (22) از فعالیت مشابهی را در سرطان سینه حمایت می کند. در تطابق با Garcia-Tunon و همکاران (20)، ما همراهی میان میزان بیان IFNG و وضعیت ER/PR پیدا نکردیم. Mostafa و همکارانش تاثیرات سرکوب کننده بر روی سیگنالدهی IFNG نشان دادند که نتیجه اش فرار از سیستم ایمنی در سلول های سرطان سینه ERα مثبت است (23). با این حال، چنین تاثیرات سرکوب کننده ای الزاما به بیان خود IFNG اعمال نمی شود. مطالعات آینده برای ارزیابی اثر استرادیول یا گیرنده آن بر بیان IFNG ضروری است. ما سطوح بالاتری از IFNG-AS1 را بافت های سرطان سینه در مقایسه با ANCTs یافتیم. این یافته ها ممکن است دلیل و نتیجه پروسه تومورزایی باشد. مطالعات آینده عملکردی برای بررسی عواقب چنین بیان بیش از حدی در بافت سرطان سینه لازم است. همانطور که مطالعات سابق این بیان بیش از حد را به شرایط خودایمن ربط داده است، این احتمال نیز وجود دارد که چنین بیان بیش از حدی مکانیسم جبرانی برای عالب شدن بر فرار از از سیستم ایمنی در محیط میکروسکوپی تومور باشد. Critchley-Throne و همکارانش تأثیر IFNG در لنفوسیتهای خون محیطی را از بیماران مبتلا به سرطان سینه بررسی کردند و یافتند که سیگنال ناشی از IFNG کاهش یافته سیگنال دهی در سلولهای B این بیماران را به رغم سیگنالینگ نرمال در سلول های T یا سلول های قاتل طبیعی القا می کند (24). شایا ذکر است، هیچ گونه تفاوتی در مراحل دوم، سوم و چهارم بیماران سرطان سینه یافت نشد (24) که در تطابق با یافته های ما با توجه به میزان بیان مشابه ژن IFNG در گروه های وابسته به هیستوپاتولوژی است. در نتیجه، یک مکانیزم نظارتی وابسته به سلول برای عملکرد IFN وجود دارد. بنابراین، مطالعات آینده برای بررسی چنین مکانیسمی در بافت های اپیتلیال بدست آمده از تومورهای سرطان سینه برای پیدا کردن اینکه آیا این پاسخ های عملکردی در بافت سرطانی اختلال ایجاد می کند لازم است. به علاوه، اهمیت بیان محلی IFNG و IFNG-AS1 در پاسخ به درمان سیستمیک با IFNG در بیماران سرطان سینه باید در تحقیقات مطالعه شود. جدا از عواقب عملکردی اختلال در IFNG-AS1 در بافت های سرطان سینه، سطوح رونوشت این ژن ممکن است برای اهداف تشخیصی در پنل بیومارکرهای احتمالی متشکل از ژن های کد کننده و غیرکدکننده استفاده شوند. با این حال، بر اساس نتایج آنالیز منحنی ROC، هیچ یک از ژن های ارزیابی شده در این مطالعه الزامات را به عنوان بیومارکر فردی ندارند. تعدادی از مطالعات تشابهاتی میان سرطان و neurodegenerative به ویژه از لحاظ مسیرهای سیگنالینگ که بقای سلول و مرگ و ترمیم آسیب DNA را تنظیم می کنند، نشان می دهند (25). PINK1 در میان ملکول هایی است که در پاتوژنز بیماری های neurodegenerative و سرطان دخیل است (25). این پروتئین در اصل بر اساس تحریک آن توسط سرکوبگر تومور PTEN در سلولهای سرطانی تعیین شده است. در حالیکه، یک کنترل کننده مثبت انتقال چرخه سلولی است که خاموش شدنش به صورت قابل توجهی تکثیر سلولی، شکل گیری کلونی و تهاجم در فیبروبلاست های جنینی نامیرا را کاهش می دهد (26). با این حال در برخی از مطالعات گفته شده که بیان بیش از حد PINK1 رشد سلولی را سرکوب نمی کند (27). از سوی دیگر، بیان PINK1 توسط مسیر سیگنال دهی PI3-Kinase/Akt کنترل می شود که از نقشش در پروسه سرطان زایی حمایت می کند (28). نتایج مطالعات سابق پیشنهاد کرده است که عملکرد مخالف یا متفاوتی حتی در نوع خاصی از بدخیمی داشته باشد همانطور که توسط توالی ضد آپوپتوزی و توده سرطانی تشکیل دهنده کلونی در سلول های سرطانی پستان دیده می شود (7). بر اساس تضاد بین نتایج مطالعات قبلی در مورد نقش PINK1 در پاتوژنز سرطان، ما بیان آن را در نمونه های بافت سینه مورد بررسی قرار دادیم و تنظیم منفی PINK1 را در نمونه های مجزای مهاجم سرطانی در مقایسه با ANCT متناظر آنها نشان دادیم. چنین مشاهدات تنظیم منفی PINK1 در بافت های توموری سینه در تطابق با نقش فرضی آن در ارتباط با مسیر BRCA1 بر اساس همولوژی توالی با BRCA2 می باشد (29). بنابراین، ما فرض کردیم که این تنظیم منفی ممکن است از نبود بیان BRCA1 در سلول های سرطان سینه تقلید کند. مطالعات آینده برای بررسی این احتمال ضروری است. ما همزمان میزان بیان PINK1-AS را در نمونه های مشابه بیماران ارزیابی کردیم و تفاوتی در میزان بیانش بین بافت های توموری و ANCTs نیافتیم. PINK1-AS یک LncRNA است که تثبیت کننده RNA کدینگش است (30). چنین نقش های فرضی برای PINK1-AS توسط مشاهدات ارتباط مثبت میان میزان بیان PINK1 و PINK1-AS در بافت های توموری و ANCTs حمایت شده است. همبستگی قوی تری در بافت های توموری ممکن است منجر به حضور یک مکانیزم جدید نظارتی برای جبران تنظیم منفی PINK1 در بافت های توموری شود که باید در مطالعات آینده ارزیابی شود. ما ارتباطی بین میزان بیان PINK1 و نرخ میتوزی مشاهده کردیم که با نقش پیشنهادی این ژن در تنظیم سیگنال دهی PI3-kinase / Akt / mTOR مطابقت دارد (28) و مطالعات عملکردی را برای شفاف سازی مکانیسم مربوطه و کاربرد عملکردی آن در مدیریت سرطان را تضمین می کند. ما همچنین تمایل به بیان بیش از حد PINK1 را در بیماران جوان تر در مقایسه با بیماران مسن تر (P=0.09) و تومورهای درجه دوم در مقایسه با درجه سوم (P=0.08) یافتیم. با فرض اینکه نقش سرکوب کننده تومور برای PINK1 در سرطان سینه، بیان بالاتر آن در بیماران جوان تر و رده های پایین تر، ممکن است سطح بالاتری از بیان PTEN را در این بیماران نشان دهند. مطالعات آینده در تعداد نمونه های بیشتر برای تایید این همراهی، آشکار سازی مکانیسم مربوطه و ارزیابی اهمیتش در نتیجه بیماران لازم است. در نهایت، ما قدرت تشخیصی سطوح رونوشت PINK1 را در بافت های سرطان سینه ارزیابی کردیم و یافتیم که این زن می تواند وجود سرطان را با 6/79 % اختصاصیت و 9/51% حساسیت نشان دهد. براساس اختصاصیت بالای آن، این ژن ممکن است بیومارکر احتمالی در پنل بیومارکرها برای سرطان سینه باشد.

خلاصه نتایج حاصله

ویژگی های کلینیکی و قومیتی بیماران جدول 3-10 ویژگی های کلینیکی و قومیتی بیماران را نشان می دهد. جدول 3-10. اطلاعات کلی بیماران متغیرها مقادیر سن (years) (mean±SD) 51.79 ± 13.54 (29-81) Menarche age (years) (mean±SD) 13 ± 1.65 (10-18) Menopause age (years) (mean±SD) 44.91 ± 14.91 (38-60) سن اولین حاملگی (years) (mean±SD) 18.04 ± 8.36 (14-32) مدت زمان شیردهی (months) (mean±SD) 41.62 ± 34.1 (3-120) نتیجه مثبت خانوادگی برای دیگر سرطان ها (%) 17% مرحله سرطان (%) I 30.8 II 28.8 III 30.8 IV 9.6 Overall grade (%) I 17 II 49 III 34 Mitotic rate (%) I 45.2 II 42.9 III 11.9 اندازه تومور (%) <2 cm 32 >=2 cm, <5cm 66 >=5 cm 2 گیرنده استروژن (%) مثبت 87.8 منفی 12.2 گیرنده پروژسترون (%) مثبت 77.1 منفی 22.9 Her2/neu expression (%) مثبت 25 منفی 75 Ki67 expression (%) مثبت 100 منفی 0 3-4-2. بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت توموری در مقایسه با ANCTs BACE1 به صورت معناداری در بافت توموری در مقایسه با ANCTs تنظیم منفی شده است. با این حال، BACE1-AS تفاوت معناداری میان بافت های توموری و ANCTs نداشت (شکل 3-3). شکل 3-3. بیان نسبی BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری و ANCTs نتایج Bayesian t-test برای مقایسه بیان نسبی ژن های BACE1 و BACE1-As میان بافت های توموری و ANCTs در جدول 3-11 نشان داده شده است. جدول 3-11. T-test برای مقایسه بیان نسبی ژن ها میان گروه های دو تایی 95% HDI P-value Effect Size SD تفاوت بیان نسبی Posterior mean ژن ANCTs بافت های توموری [-2.58, -0.71] 0.001 -0.487 0.48 -1.637 1.02±0.67 -0.44±0.68 BACE1 [-1.37, 0.62] 0.499 0.094 0.51 -0.3562 0.63±0.5 0.42±0.43 BACE1-AS 3-4-3. همراهی میان سطوح بیان ژن ها و اطلاعات کلینیکی بیماران ما همراهی میان سطوح بیان ژن ها و مرحله سرطان را توسط مدل Bayesian Multilevel بعد از تعدیل اثرات سن ارزیابی کردیم و تفاوت معناداری در بیان BACE1 میان مراحل یک و دو سرطان یافتیم (جدول 3-12). با این حال، میزان بیان BACE1-AS میان مراحل مختلف سرطان تفاوت معناداری نداشت (جدول 3-13). جدول 3-12. نتایج Bayesian Multilevel، همراهی میان میزان بیان BACE1 و مراحل سرطان بعد از تعدیل اثرات سن 95% Credible Interval P-Value SE Estimate بیان BACE1 [0.65, 4.28] 0.035 1.25 1.81 Stage 2 [-2.14, 2.96] 0.141 1.28 0.38 Stage 3 [-3.68, 3.24] 0.8 1.77 -0.29 Stage 4 [-0.11, 0.04] 0.272 0.04 -0.03 Age جدول 3-13. نتایج Bayesian Multilevel، همراهی میان میزان بیان BACE1-AS و مراحل سرطان بعد از تعدیل اثرات سن 95% Credible Interval P-Value SE Estimate بیان BACE1-AS [-2.43, 3.34] 0.347 1.47 0.46 Stage 2 [-2.43, 3.17] 0.543 1.42 0.33 Stage 3 [-6.28, 2.04] 0.482 2.1 -2.14 Stage 4 [-0.15, 0.03] 0.248 0.05 -0.06 Age ما همچنین ارتباط میان سطوح ژن ها را در هر یک از گروه های نمونه ها و سن بیماران ارزیابی کردیم. میزان بیان BACE1 و BACE1-AS با سن بیماران در هیچ کدام از زیرگروه ها ارتباط نداشت (جدول 3-14). جدول 3-14. ارتباط میان میزان بیان ژن ها در هرکدام از زیرگروه های سنی بیماران BACE1-AS BACE1 0.059 -0.252 بافت های توموری گروه ها 0.107 -0.164 ANCTs ما همچنین همراهی بیان نسبی این ژن ها و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی را ارزیابی کردیم (جدول 3-15). میزان بیان ژن BACE1-AS در نمونه های ER مثبت در مقایسه با نمونه های ER منفی به صورت معناداری بیشتر بود (P=0.01). تفاوت معناداری میان میزان بیان ژن ها در زیرگروه های بیماران متفاوت یافت نشد. جدول 3-15. همراهی میان سطوح رونوشت ژن های مذکور در بافت های توموری و ویژگی های تومور P-Value BACE1-AS P-Value BACE1 سن 0.78 327.39 (1.54) vs. 489.87 (2.15) 0.35 3.06 (1.42) vs. 91.45 (288.38) <55 years old vs. ≥55 years old ER Status 0.09 63.68 (304.84) vs. 809.02 (2.66) 0.08 2.39 (1.26) vs. 484.36 (1.17) ER(+) vs. ER(-) PR Status 0.09 63.68 (304.84) vs. 809.02 (2.66) 0.08 571 (2.98) vs. 7.699 (2.45) PR(+) vs. PR(-) HER2 Status 0.47 1.73 (1.97) vs. 312.08 (1.49) 0.12 6.81 (2.36) vs. 666.5 (3.04) HER2 (+) vs. HER2 (-) Tumor Grade 0.95 56.93 (45.06) vs. 1.4 (1.84) 0.9 336.89 (419.44) vs. 10.6 (37.95) Grade 1 vs. 2 0.28 56.93 (45.06) vs. 1.27 (3.14) 0.47 336.89 (419.44) vs. 6.42 (2.05) Grade 1 vs. 3 0.09 1.4 (1.84) vs. 1.27 (3.14) 0.24 10.6 (37.95) vs. 6.42 (2.05) Grade 2 vs. 3 3-4-4. همراهی میان میزان بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری و ANCTs ارتباط معناداری میان میزان بیان این ژن ها و بافت های توموری و همچنین ANCTs یافت شد (شکل 3-4 A و B). شکل 3-4. همراهی میان میزان بیان BACE1 و BACE1-AS در بافت های توموری (A) و ANCTs (B) 3-4-5. بیان نسبی IFNG و IFNG-AS1 در بافت سرطان سینه در مقایسه با ANCTs IFNG-AS1 در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs به صورت معنادری تنظیم مثبت شده بود (Expression ratio=2.23, P=0.03). اگرچه میزان بیان IFNG در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs بیشتر بود (بیان نسبی= 1.89)، ولی به سطح معناداری نرسیده بود (P=0.07). شکل 3-5 معیار CT را در بافت های توموری و ANCTs نشان می دهد. شکل 3-5. بیان نسبی IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCTs 3-4-6. همراهی میان سطوح رونوشت های IFNG و IFNG-AS1 و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران مامیزان بیان IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCT مقایسه کردیم و بیماران را بر اساس این معیارها به گروه های تنظیم مثبت و منفی طبقه بندی کردیم. IFNG و IFNG-AS1 به ترتیب در بافت های توموری بدست آمده از 35 فرد و 37 فرد تنظیم مثبت شده بودند. متعاقبا، ما همراهی میان اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی و بیان نسبی ژن های IFNG و IFNG-AS1 را ارزیابی کردیم. همراهی معناداری میان اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران و تغییرات بیان این ژن ها در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs یافت نشد. جدول 3-16 نتایج آنالیز همراهی میان بیان نسبی این ژن ها در بافت توموری در مقایسه با ANCTs و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی را نشان می دهد. جدول 3-16. نتایج آنالیز همراهی میان بیان نسبی ژن های مذکور در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs و اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی بیماران IFNG Up-regulation IFNG Down-regulation P value IFNG-AS1 Up-regulation IFNG-AS1 Down-regulation P value سن 0.57 0.3 <55 years 23 (67.6%) 11 (32.4%) 25 (73.5%) 9 (26.5%) ≥55 years 12 (60%) 8 (40%) 12 (60%) 8 (40%) Stage 0.95 0.25 1 9 (56.3%) 7 (43.7%) 10 (62.5%) 6 (37.5%) 2 10 (66.7%) 5 (33.3%) 9 (60%) 6 (40%) 3 11 (68.8%) 5 (31.2%) 14 (87.5%) 2 (12.5%) 4 4 (80%) 1 (20%) 3 (20%) 2 (80%) Histological Grade 0.87 0.91 1 5 (62.5%) 3 (37.5%) 6 (75%) 2 (25%) 2 16 (69.6%) 7 (30.4%) 15 (62.5%) 8 (34.8%) 3 10 (62.5%) 6 (37.5%) 12 (75%) 4 (25%) Mitotic Rate 0.9 0.64 1 13 (68.4%) 6 (31.6%) 14 (73.7%) 5 (26.3%) 2 11 (61.1%) 7 (38.9%) 11 (61.1%) 7 (38.9%) 3 3 (60%) 2 (40%) 4 (80%) 1 (20%) اندازه تومور 0.7 0.67 <2 9 (56.3%) 7 (43.7%) 12 (75%) 4 (25%) 2-5 22 (66.7%) 11 (33.3%) 21 (63.6%) 12 (36.4%) >5 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) ER Status 0.08 0.65 مثبت 26 (60.5%) 17 (39.5%) 29 (67.4%) 14 (32.6%) منفی 6 (100%) 0 (0%) 5 (16.7%) 1 (83.3%) PR Status 0.07 0.46 مثبت 22 (59.5%) 15 (40.5%) 25 (67.6%) 12 (32.4%) منفی 10 (90.9%) 1 (9.1%) 9 (81.8%) 2 (18.2%) Her2 Status 0.48 0.27 مثبت 7(58.3%) 5(41.7%) 7 (58.3%) 5 (41.7%) منفی 25(69.4%) 11(30.6%) 27 (75%) 9 (25%) در مرحله بعد بیان نسبی هر یک از ژن ها در نمونه های توموری میان زیرگروه ها بر اساس اطلاعات کلینیکی پاتولوژیکی مقایسه شد (جدول 3-17). میزان بیان IFNG در بافت های توموری HER2 منفی در مقایسه با HER2 مثبت (P=0.01)و نمونه های درجه یک در مقایسه با درجه دو به صورت معناداری بیشتر بود (P=0.03). تفاوت معنادار دیگری در بیان این ژن ها میان گروه های دیگر یافت نشد. جدول 3-17. مقایسه سطوح بیان ژن های IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری سرطان سینه بیماران و خصوصیات کلینیکی پاتولوژیکی IFNG P value IFNG-AS1 P value سن <55 years vs. ≥55 years 0.03 (0.05) vs. 0.01 (0.02) 0.09 0.015 (0.02) vs. 0.006 (0.008) 0.07 ER Status ER(+) vs. ER(-) 0.03 (0.05) vs. 0.02 (0.01) 0.66 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.97 PR Status PR(+) vs. PR(-) 0.03 (0.05) vs. 0.02 (0.02) 0.74 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.92 HER2 Status HER2 (+) vs. HER2 (-) 0.009 (0.01) vs. 0.03 (0.05) 0.01 0.01 (0.01) vs. 0.01 (0.02) 0.57 Tumor Grade Grade 1 vs. 2 0.06 (0.08) vs. 0.01 (0.03) 0.03 0.02 (0.02) vs. 0.01 (0.02) 0.73 Grade 1 vs. 3 0.06 (0.08) vs. 0.02 (0.02) 0.1 0.02 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.69 Grade 2 vs. 3 0.01 (0.03) vs. 0.02 (0.02) 0.89 0.01 (0.02) vs. 0.01 (0.01) 0.99 3-4-7. همراهی میان سطوح رونوشت های IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری و ANCTs ارزیابی همراهی میان میزان بیان ژن های IFNG و IFNG-AS1 ارتباط قوی میان سطح بیان آن ها در بافت های توموری و ANCTs نشان داد (شکل 3-6 A و B). A B شکل 3-6. همراهی میان میزان بیان IFNG و IFNG-AS1 در بافت های توموری (A) و ANCTs (B) 3-4-8. آنالیز منحنی ROC براساس نتایج منحنی ROC IFNG و IFNG-AS1 برای شناسایی وضعیت بیماری به ترتیب 3/83 % اختصاصیت و 2/85 % حساسیت میزان بیان داشت. نتایج آنالیز منحنی ROC در شکل 3-7 و جدول 3-18 نشان داده شده است. شکل 3-7. منحنی ROC برای پیش بینی وضعیت بیماری براساس سطوح بیان IFNG و IFNG-AS1 جدول 3-18. نتایج آنالیز منحنی ROC Estimate criterion AUC J حساسیت اختصاصیت P-value IFNG > 0.007 0.664 0.37 53.7 83.3 0.002 IFNG-AS1 >0.0001 0.665 0.25 85.2 40.7 0.001 ترکیبی از هر دو ژن >0.47 0.665 0.33 61.1 72.2 0.001 3-4-9. بیان نسبی PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه در مقایسه با ANCTs میزان بیان PINK1 در نمونه های توموری در مقایسه با ANCTs به صورت معناداری کمتر بود (Fold change=0.19, P=0.003). با این حال، میزان بیان PINK-AS1 میان بافت های توموری و ANCTs تفاوت نداشت (Fold change=0.64, P=0.36). شکل 3-8 بیان نسبی این ژن ها را در بافت های توموری و ANCTs نشان می دهد. شکل 3-8. بیان نسبی در بافت های توموری و ANCTs 3-4-10. همراهی میان بیان ژن ها و ویژگی های تومور ما بیان نسبی ژن ها را در نمونه های توموری در مقایسه با ANCT ارزیابی کردیم و بیماران را برای هر یک از ژن ها بر اساس معیارهایشان به گروه های تنظیم مثبت و منفی طبقه بندی کردیم. ما متعاقبا همراهی میان بیان نسبی ژن ها و ویژگی های تومور را ارزیابی کردیم (جدول 3-19). جدول 3-19. همراهی میان بیان نسبی ژن ها در بافت های توموری در مقایسه با ANCTs و ویژگی های تومور PINK1 up-regulation PINK1 down-regulation P value PINK1-AS1 up-regulation PINK1-AS1 down-regulation P value سن 0.56 0.72 <55 years 11 (32.4%) 23 (67.6%) 12 (35.3%) 22 (64.7%) ≥55 years 5 (25%) 15 (75%) 8 (40%) 12 (60%) Stage 0.07 0.6 1 4 (25%) 12 (75%) 5 (31.3%) 11 (68.7%) 2 3 (20%) 12 (80%) 4 (26.7%) 11 (73.3%) 3 3 (18.8%) 13 (81.2%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) 4 4 (80%) 1(20%) 3 (60%) 2 (40%) Histological grade 0.1 0.92 1 2 (25%) 6 (75%) 2 (25%) 6 (75%) 2 3 (13%) 20 (87%) 8 (34.8%) 15 (65.2%) 3 7 (43.8%) 9 (56.3%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) Mitotic rate 0.03 0.64 1 2 (10.5%) 17 (89.5%) 6 (31.6%) 13 (68.4%) 2 6 (33.3%) 12 (66.7%) 7 (38.9%) 11 (61.1%) 3 3 (60%) 2 (40%) 2 (40%) 3 (60%) Tumor size 0.4 0.58 <2 4 (25%) 12 (75%) 6 (37.5%) 10 (62.5%) 2-5 9 (27.3%) 24 (72.7%) 11 (33.3%) 22 (66.7%) >5 1 (100%) 0 (0%) 1(100%) 0 (0%) ER status 0.33 0.65 Positive 11 (25.6%) 32 (74.4%) 15 (34.9%) 28 (65.1%) Negative 3 (50%) 3 (50%) 3 (50%) 3 (50%) PR status 0.11 0.46 Positive 8 (21.6%) 29 (78.4%) 11 (29.7%) 26 (70.3%) Negative 5 (45.5%) 6 (54.5%) 6 (54.5%) 5 (45.5%) Her2 status 0.71 0.6 Positive 4 (33.3%) 8 (66.7%) 5 (41.7%) 7 (58.3%) Negative 9 (25%) 27 (75%) 12 (33.3%) 24 (66.7%) ما همچنین میزان بیان PINK1 و PINK1-AS را میان زیرگروه ها بر اساس ویژگی های کلینیکی پاتولوژیکی تومورها مقایسه کردیم و تمایل به سوی بیان بیش از حد PINK1 در بیماران جوان تر در مقایسه با پیرتر (P=0.09) و تومورهای درجه دو در مقایسه با درجه سه (P=0.08) یافتیم (جدول 3-20). جدول 3-20. همراهی میان سطوح رونوشت ژن ها در بافت های توموری و ویژگی های توموری PINK1 expression P value PINK1-AS1 expression P value سن <55 years old vs. ≥55 years old 7.12 (2.56) vs. 6.21 (1.81) 0.09 3406.35 (86.84.56) vs. 7424.23 (21455.68) 0.34 ER Status ER(+) vs. ER(-) 4.19 (2.11) vs. 1.03 (2.52) 0.51 4166.08 (13378.33) vs. 2086.09 (2719.47) 0.73 PR Status PR(+) vs. PR(-) 3.66 (2.17) vs. 9.73 (2.19) 0.42 2632.01 (8284.69) vs. 1726.18 (2373.62) 0.73 HER2 status HER2 (+) vs. HER2 (-) 3.8 (1.29) vs. 5.47 (2.4) 0.82 830.67 (1894.92) vs. 3001.36 (8489.03) 0.38 Tumor Grade Grade 1 vs. 2 2.05 (3.05) vs. 4.23 (1.25) 0.9 9503.13 (16191.96) vs. 1128.86 (2255.95) 0.21 Grade 1 vs. 3 2.05 (3.05) vs. 1.49 (3.63) 0.25 9503.13 (16191.96) vs. 5371.4 (17653.05) 0. 71 Grade 2 vs. 3 4.23 (1.25) vs. 1.49 (3.63) 0.08 1128.86 (2255.95) vs. 5371.4 (17653.05) 0.55 3-4-11. ارتباط بین میزان بیان PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه و ANCTs ما ارتباط معناداری میان بیان نسبی این ژن ها در بافت های توموری و ANCTs یافتیم (شکل 3-9 و شکل 3-10). بر اساس معیار R2 محاسبه شده، همراهی در بافت های توموری قوی (R2=0.89) و در ANCTs متوسط بود (R2=0.35). شکل 3-9. ارتباط بیان میان PINK1 و PINK1-AS در نمونه های سرطان سینه شکل 3-10. ارتباط میان بیان PINK1 و PINK1-AS در ANCTs 3-4-12. آنالیز نمودار ROC آنالیز منحنی ROC برای سطح رونوشت PINK1 در تشخیص سرطان سینه اختصاصیت 6/79% و حساسیت 9/51% نشان داد (شکل 3-11 و جدول 3-21). شکل 3-11. نتایج آنالیز نمودار ROC برای ارزیابی قدرت PINK1 جدول 3-21. نتایج آنالیز نمودار ROC Estimate criterion AUC J حساسیت اختصاصیت P-value PINK1 transcript levels > - 9.81 0.62 0.31 51.9 79.6 0.02

فایل های پژوهش