پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله سرطان سینه شایعترین بدخیمی در میان زنان جهان و دومین سرطان شایع بعد از سرطان ریه می باشد. سرطان سینه به دلیل پیش اگهی نامطلوبی که دارد بطور کلی پنجمین علت مرگ محسوب می شود. با وجود پیشرفت های زیادی در زمینه درمان و شناخت مکانیسم های مولکولی درگیر در این بیماری ولی همچنان عوامل بسیاری در ابن بیماری ناشناخته باقی مانده اند. یکی از مهم ترین آنها Cancer stem cells (CSCs) می باشند که از خصوصیات بارز این سلول های قدرت تکثیر پایین ولی در مقابل مقاومت آنها به داروهای شیمی درمانی و همچنین رادیوتراپی می باشد. از ماکرهای اختصاصی این سلول ها، می توان به CD44+/CD24- اشاره کرد. از عوامل ایجاد کننده این سلول ها، محیط پیرامون این تومور ها و سایتوکین های ترشحی می باشد که از مهترین آنهاInterleukin-6 (IL-6) می باشد که از طریق فعال کردن مسیر phosphatidylinositol-3 kinase/Akt kinase (PI3-K/Akt/mTOR) ، نقش بسیاری مهمی در رشد این سلول ها ایفا می کند. تنظیم نادرست مسیر PI3K/AKT یکی از شایع ترین موارد دخیل درایجاد و توسعه سرطان سینه است. سیتوکین هایی مثلIL-6 باعث القای فعالیت مسیر PI3K/AKT شده به گونه ای که عملکردهای درمانی برای مهار مسیرPI3K/AKT را جبران می کند. از دیگر عوامل دخیل در ایجاد CSCs مسیر SIRT1 می باشد که منجر به رشد تکثیر این سول های می شود. بنابراین شناسایی مسیر های تداخلی با SIRT1 می تواند مشخص کننده راه حل هایی برای درمان ترکیبی جدید باشد. در این مطالعه قصد بر این است که با تیمار سلول ها با IL-6 و سپس با مهار کننده های اختصاصی مسیر PI3K/AKT (NVP-BEZ235) و مهارکننده مسیر SIRT1 (EX-527) به صورت تکی و ترکیبی ، به میزان اثرپذیری این مهار کننده ها در شیمی درمانی پی برده تا در آینده بتوان از آن برای طراحی درمان های ترکیبی استفاده کرد. بنابراین از دو لاین متاستاتیک و غیر متاستاتیک سرطان سینه استفاده شد. به گونه ای که میزان سلول های بنیادی لاین های سرطانی را در مجاورت حضور IL-6، NVP-BEZ235، SIRT1 بررسی شدند. بعد از بررسی مطالعات آزمایشگاهی نشان داده شد که کاهش جمعیت سلول های بنیادی سرطان در سلول های متاستاتیک MDA-MB231 مقاوم به تیمار های انجام شده بوده در صورتی که حضور سیتوکین IL-6 به مدت دوهفته منجر به کاهش چشمگیر این جمعیت سلولی در رده لومینال سرطان سینه MCF-7 می شود. به دلیل اثرات مهارکنندگی IL-6 بر کاهش جمعیت سلول های CSC می توان با بررسی مکانیسمی این سیتوکین از آن به عنوان گزینه مناسبی جهت جلوگیری از متاستاز و القا مقاومت دارویی باشد. همچنین با بررسی مکانیسم های مقاومتی سلول های MDA-MB231، پیشنهاد می گردد که که در مطالعات بعدی با بررسی مکانیسم اثر این سیتوکین بتوان مکانیسم موثر در جلوگیری از القا پیشرفت و متاستاز سرطان را شناسایی کرد و نهایتا بر روی نمونه حیوانی و انسانی مورد ارزیابی قرار گیرد. روش اجرا تهیه وتیمار سلول های مورد استفاده لاین های سلولی MCF-7 و MDA-MB-231 را از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری و در محیط RPMI که حاوی 10% سرم جنین گاوی ، 1 درصد پنی سیلین- استرپتومایسین Pen-strep) )، گلوتامین (3mg/ml) کشت داده شدند و در انکوباتور 37 درجه با %5 CO2 و رطوبت 98% قرار گرفتند. سپس این دو لاین سلولی را در غلظت IC50 NVP-BEZ235 و EX-527 و غلظت ED50 سیتوکین IL-6 به صورت جداگانه و ترکیبی به مدت 24 و 48 ساعت تیمار کرده و سپس سلول ها را برای بررسی درصد آپوپتوز و تعیین درصد سلول های بنیادی با فلوسیتومتری خوانش کردیم. به منظور به دست آوردن NVP-BEZ235 IC50 و EX527 ابتدا سلول های از فلاسک به وسیله تریپسین کنده شده و به تعداد 10000 در هر چاهک از پلی ت 96 خانه کشت داده می شوند و تحت تیمار با غلظت های مختلف NVP-BEZ235 قرار می گرند. . تمام غلظت‌ها به‌صورت سه‌تایی گذاشته شد‌ و از سلول بدون دارو به‌ عنوان کنترل استفاده گردید. بعد از 24 یا 48 ساعت محلول MTT اضافه شده و به مدت 3 ساعت انکوبه می شود. سپس 200 لاندا DMSO به منظور حل کردن کریستال های فورمازان به هر چاهک اضافه شده و بر روی شکیر قرار گرفته و سپس جذب نوری چاهک ها را با در طول موج 590 نانومتر خوانده شد. میزان جذب نوری و شدت رنگ ایجاد شده با تعداد سلول های زنده نسبت مستقیم دارد. درصد سلول های زنده و مرده را با ترسیم منحنی استاندارد محاسبه وبدین صورت IC50 محاسبه گردید. سپس سلولها را همراه با (ng/ml10) IL-6 به مدت دو هفته کشت داده. سلول های تیمار شده با IL-6 وتیمار نشده را به مدت 24 یا 48 ساعت به طور جداگانه و ترکیبی با مهارکننده‌های NVP-BEZ235 و EX527 تیمار و انکوبه کرده و سپس سلول های تیمار شد. برای بررسی درصد CSC بعد از تیمارهای انجام شده، سلول ها به وسیله تریپسین کنده شده و به وسیله محیط کشت حاوی FBS خنثی می شوند. بعد از سانتریفوژ پلت سلولی در Buffer stain حل شده و به تعداد 1000000 سلول به لوله های مخصوص دستگاه فلوسایتومتری انتقال داده می شوند و 5 لاندا از آنتی بادی های ضد CD44 و CD24 کونژوگه با فلوروکروم به هر لوله اضافه شده و بعد از 30 دقیقه انکوباسیون در 4 درجه توسط دستگاه فلوسایتومتری خوانش شد. یافته ها نتایج حاصل از فلوسیتومتری در سلول های MCF-7 تیمار شده در مقایسه با سلول های تیمار نشده نشان داد که درصد سلول های بنیادی (CSC) در رده MCF-7 تیمار شده با NVP-BEZ235 و EX-527 به مدت 24 یا 48 ساعت، به صورت تکی و یا ترکیبی افزایش معنی داری داشته. همچنین بر خلاف گروه های تیمار شده با NVP-BEZ235 یا EX-527، تیمار دوهفته ای IL-6 مانع از افزایش این سلول ها شده به گونه ای که درصد سلول های بنیادی در این گروه کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل داشته است (نمودار شماره 1). تیمار تکی یا ترکیبی سلول های از قبل تیمار شده با IL-6 نشان داد که سلول های MCF-7 نسبت به افزایش جمعیت درصد سلول های بنیادی توسط NVP-BEZ235 بعد از 24 یا 48 ساعت مقاوم بوده و به صورت معنی داری کمتر از سلول های کنترل می باشد ولی EX-527 اثر حضور IL-6 را مهار کرده به گونه ای که این کاهش جمعیت نسبت به گروه کنترل معنی دار نبوده. (نمودار شماره 1). تیمار ترکیبی سلول ها با IL-6 , NVP-BEZ235 و EX-527 بعد از 24 ساعت منجر به کاهش معنی دار سلول های بنیادی نسبت به گروه کنترل شده در صورتی که بعد از 48 ساعت این کاهش جمعیتی معنی دار نبوده است (نمودار شماره 1). بحث و نتیجه گیری نتایج حاصل پس از بررسی سلول های بنیادی در رده MCF-7 نشان داد که تمایز به این سلول ها در اثر حضور IL-6 به مدت 2 هفته منجر به کاهش این جمعیت سلولی شده است. البته جمعیت CSCs در گروه هایMCF-7 تیمار شده با NVP-BEZ235 یا EX-527 به صورت تکی یا ترکیبی افزایش داشته. البته رفتار IL-6 به گونه ای بوده که تیمار دوهفته ای این سلولها با این سیتوکین مانع از افزایش CSCs در گروه های ترکیبی تیمار شده بوده است. نتایج حاصل از این مطالعه همسو با مطالعه Tuccito و همکاران بوده، آنها نیز سلول ها را به مدت 2 هفته در مجاورت IL-6 قرار گرفته بودند(45) . بررسی اثر تیمارها بر روی رده متاستاتیک MDA-MB231 سرطان سینه نشان داد که این سلولها اکثرا مارکر CSC ها را بیان کرده و انجام تیمار های مختلف تاثیر چندانی بر این جمعیت سلولی نداشته است. هر چند ترکیب IL-6 مهار کننده SIRT1 به صورت معنی داری باعث افزایش این جمعیت سلولی شده است. تمامی نتایج به دست آمده مستقل از زمان بوده و تفاوت چندانی بین تیمار های 24 ساعته و 48 ساعته دیده نشده است.

خلاصه نتایج حاصله

نتایج حاصل از فلوسیتومتری در سلول های MCF-7 تیمار شده در مقایسه با سلول های تیمار نشده نشان داد که درصد سلول های بنیادی (CSC) در رده MCF-7 تیمار شده با NVP-BEZ235 و EX-527 به مدت 24 یا 48 ساعت، به صورت تکی و یا ترکیبی افزایش معنی داری داشته. همچنین بر خلاف گروه های تیمار شده با NVP-BEZ235 یا EX-527، تیمار دوهفته ای IL-6 مانع از افزایش این سلول ها شده به گونه ای که درصد سلول های بنیادی در این گروه کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل داشته است (نمودار شماره 1). تیمار تکی یا ترکیبی سلول های از قبل تیمار شده با IL-6 نشان داد که سلول های MCF-7 نسبت به افزایش جمعیت درصد سلول های بنیادی توسط NVP-BEZ235 بعد از 24 یا 48 ساعت مقاوم بوده و به صورت معنی داری کمتر از سلول های کنترل می باشد ولی EX-527 اثر حضور IL-6 را مهار کرده به گونه ای که این کاهش جمعیت نسبت به گروه کنترل معنی دار نبوده. (نمودار شماره 1). تیمار ترکیبی سلول ها با IL-6 , NVP-BEZ235 و EX-527 بعد از 24 ساعت منجر به کاهش معنی دار سلول های بنیادی نسبت به گروه کنترل شده در صورتی که بعد از 48 ساعت این کاهش جمعیتی معنی دار نبوده است (نمودار شماره 1).

فایل های پژوهش