پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله ترمیم زخم یک فرآیند پیچیده است که شامل فعل و انفعالات هماهنگ بین سیستم های بیولوژیکی و ایمونولوژیکی است(1). تنظیم ‏زمان و فعل و انفعالاتی که بین اجزا صورت میگیرد برای زخم های حاد و مزمن متفاوت است ، اگرچه فاز های اصلی یکسان ‏است(4-2) فرآیند های گوناگون ترمیم بافت حاد که در آسیب بافتی به راه افتاده است ، ممکن است به صورت توالی پیوسته از چهار فاز ‏وابسته به زمان باشد ‏. ‏فاز انعقاد و جلوگیری از خون ریزی ‏، فاز التهاب ،فاز افزایش سریع تعداد سلول ها (تکثیر سلولی)‏ ، فاز تغییر شکل و ساختار جای زخم.(8-5) کیتوزان از مشتقات دی استیل شده ی کیتین پلی مری طبیعی است که در پوست خرچنگ و دیواره ی قارچ ها یافت می شود (11-9) و به ‏دلیل خواص منحصر به فردی مانند زیست تخریب پذیری(12)، غیر سمی بودن(13) ، آثار ضد باکتریایی (16-14)، زیست سازگاری ، مخاط ‏چسبندگی و آسان سازی تشکیل استخوان (19-17)و نیز قیمت کم آن به عنوان یک زیست ماده برای کاربرد هایی مانند مهندسی بافت و ‏دارو رسانی مورد استفاده قرار گرفته است(21-19). همچنین زخم پوش مورد مطالعه حاوی ماده ی ‏DACC‏ و پلی کاپرولاکتان می باشد (22)که کمک به جذب میکرواورگانیسم های زخم و ‏بهبود آن می گردد(23). دی آلکیل کاربامیل کلراید یک مولکول غیر قطبی و آب گریز می باشد که طبق اصل جذب دو ماده ی آب ‏گریز به یکدیگر در محیط آبی و به دلیل آب گریز بودن مولکول های سطحی ساختار میکرو اورگانیسم های پاتوژن زخم(25،24) ،به ‏سرعت این مواد جذب زخم پوش می گردند و فرصت جهت کلاژن سازی و بهبود و ترمیم زخم به وجود می آید(28-26). از نمونه هیدروژل ها و پانسمان ها موجود در بازار می توان به کامفیل اشاره کرد که از ذرات سلولزی تشکیل شده است که در یک توده ی الاستیک و چسبنده قرار گرفته اند.هنگامی که پانسمان روی زخم قرار می گیرد این ذرات در تماس با اگزودای زخم آن را جذب می کنند و ترکیب ژل مانندی تشکیل می دهند که بستر مناسبی را برای درمان مرطوب زخم به وجود می آید(29). از موارد دیگر زخم پوش ها و ژل ها می توان به تکنولوژی جدید پانسمان آ کواسل نقره دار که تمامی مزایای هیدروفایبر را داراست اشاره کردکه علاوه بر آن حاوی یون نقره است که خاصیت کشندگی میکرواورگانیسم ها را دارد.اما یون نقره سبب به جا ماندن اسکار حاصل از زخم بر روی پوست می ماند(30). از نمونه های دیگر پانسمان های زخم پوش می توان به سوربکت اشاره کرد که با خاصیت آب گریزی ، سبب جذب میکرواورگانیسم ها می شوند(31). همچنین به تازگی با استفاده از نانو الیاف کیتوزان و داروی میلتفوسین هیدروژلی برای درمان لیشمانیازیس جلدی را در مدل حیوانی طراحی و تولید شد که اثر مناسبی داشت و باعث بهبود زخم حاصل از لیشمانیازیس گردید(32) اما نوآوری زخم پوش مورد نظر این می باشد که با توجه به خواص کیتوسان از نظر جاذب بودن رطوبت و خواص آنتی باکتریال بودن آن و همچنین با توجه به خاصیت دی آلکیل کاربامیل کلراید که خاصیت آب گریزی دارد و با توجه به جذب دو ماده ی آب گریز در محیط آبی و با توجه به آب گریز بودن پوشش میکرواورگانیسم ها ، زخم پوش بسیار قدرتمند و هوشمندی مورد انتظار است که به سبب کیتوزان قدرت اثر آن چند برابر می گردد. در حقیقت ترکیب ماده آب گریز DACC همراه با کیتوسان تاثیرات بسیار موثری بر بهبود زخم ایجاد می کندهمچنین کیتوزان در تهیه فرمولاسیون های داروهای مختلف با رهایش کنترل شده ، استفاده میشود همچنین امکان ایجاد تغییرات شیمیایی در کیتوزان وجود دارد به عنوان مثال می توان گروه های شیمیایی را از طریق پیوند های کووالان به ساختار اسکلت آن وارد کرد و بدین ترتیب مشتقات مناسبی از آن تهیه کرد که ویژگی های فیزیکوشیمیایی خوب و کارایی انتقال عالی دارند به این معنی که در آینده این زخم پوش هوشمند قابل ارتقا و کارایی آن را می توان افزایش داد.(33). روش اجرا .نوع مطالعه، جمعیت مورد مطالعه و حجم نمونه مطالعه تجربی ، 15 سر موش 3-3-2.روش نمونه گیری این مطالعه بر روی موش سوری بالپسی صورت گرفته و زخم ایجاد گردیده است 3-3-5 روش گردآوری داده ها عکس برداری از زخم موش ها جهت پایش زخم ها با استفاده از دوربین عکاسی Cannon صورت گرفت و برای تست زیست سازگاری نتایج حاصل را با استفاده از روش جذب نوری با دستگاه الایزا انجام گردید. 3-3-6 روش تجزیه و تحلیل داده ها پس از گردآوری داده ها ، اطلاعات حاصل با استفاده از نرم افزار های image j و SPSS انجام شد.داده ها به صورت عدد وارد spss جهت ارزیابی آماری صورت پذیرفت و جهت محاسبه ی مساحت زخم ها ، از عکس ها به عنوان داده استفاده شد. 3-3-7 متغیر ها مساحت زخم (کمی پیوسته ) – میزان جذب نوری (کمی پیوسته) – مساحت هاله ی اطراف داربست روی محیط کشت در تست آنتی باکتریال ( کمی پیوسته ) 3-3-8 محدودیت های پژوهش این پژوهش به دلیل شرایط بد مالی توان انجام آزمایشات مکانیکی مورد نیاز را نداشت.به دلیل امکان آلوده شدن لانه ی حیوانات ، امکان آلوده سازی زخم موش ها به باکتری ها با سوش های متفاوت وجود نداشت. 3-3-8. شرح روش انجام کار ابتدا 3 سی سی محلول 2% کیتوزان با اسید استیک 80 % و71/0 سی سی محلول پلی اتیلن اکساید 5/3% با اسید استیک 0.5 مولار تهیه شد.برای ساخت محلول پلی کاپرو لاکتون، مقدار 6/0 گرم پلی کاپرولاکتون را در 4 سی سی اسید استیک گلاسیال حل شد تا محلول 15% جرمی حجمی ساخته شود. برای ساخت محلول DAAC حلال استون نیاز بود که طبق مقاله ، نسبت حلال ها 3 :7 بود ( 3 حجم استون به 7 حجم اسد استیک 80%). برای ساخت دو محلول 1 و 8 % با نسبت جرمی جرمی نسبت به پلی کاپرولاکتون ، مقادیر 0.0006 گرم DAAC برای غلظت یک درصد و 0.0048 گرم برای غلظت 8 درصد به 7/1 سی سی استون برای هر محلول به طور مجزا اضافه شد.برای انحلال این مواد از مگنت و استیرر استفاده شد به طوریکه برای کیتوزان و پلی اتیلن اکساید و DAAC به مدت یک شبانه روز وبرای پلی کاپرولاکتون زمان 6 ساعت از استیرر استفاده شد .سپس دو محلول را با یکدیگر مخلوط میکنیم.محلول کیتوزان PEO در یک سرنگ و محلول DAAC و پلی کاپرولاکتون را در سرنگ دیگری جمع آوری کرده و با تنظیمات ذیل الکتروریسی میکنیم: • نازل راست که حاوی سرنگ کیتوزان و PEO بود و فاصله ی 140 میلی متری تا جمع آوری کننده داشت ، و با میزان پاشش 7/0 سی سی بر ساعت و دارای 20 kV اختلاف پتانسیل بود. • نازل چپ که حاوی سرنگ PCL و DAAC بود و فاصله 150 میلی متر تا جمع آوری کننده داشت و با میزان پاشش 5/0 میلی متر بر ساعت و دارای اختلاف پتانسیل 22 kV بود. پس از الکتروریسی با استفاده از پانچ بیوپسی 6 میلی متری ، تعدادی داربست دایره ای شکل به قطر 6 میلی متر از هر غلظت تهیه شد.سپس در روز اول در تاریخ 26/2/97 تعداد 15 سر موش بالپسی را جهت ایجاد زخم و قرار دادن رینگ سیلیکونی و قرار دادن پانسمان بر روی آنها با استفاده از کتامین و زایلازین بیهوش کردیم.در طی این فرآیند تعدادی از موش ها به دلیل دریافت بیش از حد داروی بی هوشی و تعدادی هم به دلیل کهولت سن کشته شدند.در مجموع 5 موش که با استفاده از کتامین و زایلازین با نسبت 2 (کتامین) به 1 (زایلازین) به این معنی که به هر موش 3 واحد سرنگ انسولین از مخلوط کتامین زایلازین تزریق کردیم(میزان مورد نیاز داروی بی هوشی بر اساس جرم موش ها تعیین می شود که در این مطالعه موش ها تقریبا همه با جرم یکسان و حدود 30 تا 50 گرم بود) و بعد از حدود 4 تا 5 دقیقه موش به طور کامل بی هوش گشت. در این هنگام برای جلوگیری از خفگی موش زبان موش را خارج کردیم و با استفاده از وازلین برای جلوگیری از کوری موش ، سطح چشم موش را آغشته کردیم.سپس موهای پشت کمر موش را آغشته به اسپری موبر کردیم و بعد از چند دقیقه موها را با تیغ تراشیدیم و سپس برای هر موش به ترتیب زیر عمل کردیم : ابتدا موش را به پهلو خواباندیم و پوست محل مورد نظر جهت ایجاد زخم را کشیدیم و با پانچ بیوپسی 5 میلیمتری زخمی تمام عمق ایجاد کردیم که به صورت 2 زخم به طور قرینه در پشت موش ایجاد شد.پس از آن رینگ سیلیکونی تهیه شده را با مقدار کمی چسب مایع به پشت موش طوری چسباندیم که اطراف زخم گرفته شود و روی زخم جهت قرار دادن پانسمان باز باشد. سپس هر کدام از رینگ هارا به پوست موش بخیه کردیم. جدول 1- گروه بندی موش ها شماره موش پانسمان زخم سمت راست پانسمان زخم سمت چپ موش اول غلظت 0 % کنترل موش دوم غلظت 1 % کنترل موش سوم غلظت 8 % کنترل موش چهارم غلظت 1 % کنترل موش پنجم غلظت 1 % غلظت 0 % تعویض پانسمان ها به صورت یک روز در میان انجام شد و در حین تعویض پانسمان ها تصویر برداری صورت گرفت.پس از 21 روز نمونه های پوست زخم را بعد از بی هوش سازی موش با استفاده از کلروفرم ، با قیچی جراحی برش زدیم و در فرمالین جهت بررسی های پاتولوژی نگه داری کردیم. برای انجام تست آنتی باکتریال 2 سوش باکتری E.Coli و استافیلوکوک اورئوس را بر محیط کشت مولر هینتون آگار کشت دادیم و از تکه های پانچ شده ی پانسمان همانند روش دیسک دیفیوژن بر محیط کشت قرار دادیم.پس از 24 ساعت رشد باکتری و ایجاد هاله اطراف پانسمان بررسی و اندازه گیری شد. مساحت زخم ها نیز با استفاده از نرم افزار Image J و تصاویر زخم ها در روز های مختلف تخمین زده شد. برای انجام تست زیست سازگاری ، تعداد 103×20 سلول از رده Wehi، در پلیت 96 خانه ریخته و سپس مقدار 200 میکرولیتر از محیط کشت RPMI (حاوی سرم 10% ) به آن افزوده شد. خانه های پلیت جهت دوره زمانی 72 ساعت مشخص گردیدند. به مدت 24 ساعت پلیت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و CO2 5 درصد قرار گرفت. سپس مقدار 200 میکرو لیتر از دوزهای مختلف عصاره داربست ها (غلظت های 8 , 1 و صفر)، حل شده در محیط کشت RPMI ، به خانه های مربوطه افزوده گردید و مجددا در انکوباتور قرار گرفت. خانه های در نظر گرفته شده به عنوان گروه کنترل، دارو دریافت نکردند. برای هر یک از دوزهای عصاره و گروه کنترل 3 بار تکرار انجام شد. پس از پایان انکوباسیون آزمون MTT انجام شد. بدین ترتیب که ابتدا از پودر زرد رنگ MTT (از شرکت sigma)، محلول mg/ml5 تهیه گردید. سپس در محیط تاریکی، مقدار 20 میکرولیتر از محلول MTT به هر چاهک اضافه شد و به مدت 3 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. سپس محیط رویی هر چاهک تخلیه شد .برای انحلال و استخراج رسوب فورمازان تولید شده به هر چاهک 100 میکرو لیتر دی متیل سولفاکساید DMSOاضافه گردید و پس از گذشت 30 دقیقه محتوی هر چاهک به کمک دستگاه الایزا ریدر در طول موجهای 570 و 630 نانومتر قرائت شد. درصد حیات سلولها با استفاده از فرمول مربوطه، در مورد هر غلظت محاسبه گردید. 100 × (جذب نوری کنترل/جذب نوری نمونه) = قابلیت زیستی سلول ها % یافته ها در این آزمایش پس از بررسی 18 تنظیم مختلف بر روی دستگاه الکترو اسپینینگ ، در نهایت بهترین تنظیم جهت الکتروریسی به دست آمد.در این مطالعه برای به دست آوردن نانو الیاف یک دست تر و منظم تر ، به جای کلروفرم و DMF از اسید استیک گلاسیال استفاده کردیم و الیاف بسیار یک دست تر و نازک تر گشت و در مقایسه با داربست های دیگر نتایج بهتری را ثبت کرد. بر اساس بررسی های انجام شده در این تحقیق جذب عفونت و دبریدیمان زخم به پانسمان ، همچنین بهبود زخم موش ها مشاهده شد.پس از بررسی تست آنتی باکتریال ، باکتری استافیلوکوک اورئوس به پانسمان با غلظت های 8% و 1% به ترتیب بیشترین حساسیت را نشان داد ، اما در برابر پانسمان 0% مقاومت داشت و رشد کرد.باکتری E.Coil نسبت به این پانسمان مقاوم بود.در این آزمایش درصد زیست پذیری سلول های Wehi و تعداد آنها در برابر تاثیر عصاره پانسمان کاهش یافت. نتایج به دست آمده از بررسی توانایی زیستی رده سلول Wehi به روش MTT : جدول شماره 2 : مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی رده سلول wehi پس از تاثیر غلظت های متفاوت پانسمان طی 72 ساعت به روش رنگ سنجی MTT MTT- wehi Group 72h Time 15.67 0% 9.94 1% 11.56 8% در آزمایش ایجاد زخم بر روی موش در هر بار تعویض پانسمان از زخم موش تصویر برداری شد و مساحت آن با استفاده از نرم افزار Image J محاسبه و تحلیل گشت. عکس برداری از زخم ها به شرح ذیل می باشد: روز اول : تصویر اول control , 1% concentration روز سوم: -تصویر 2زخم حاصل از پانسمان 1 % تصویر 3-زخم کنترل تصویر 4- زخم با پانسمان 8 % که پانسمان روی زخم می باشد و مقداری از دبریدیمان زخم را جذب کرده است -تصویر 5 زخم دارای پانسمان 0 % در تصویر فوق مشاهده می شود که موش شماره ی 2 رینگ سیلیکونی سمت راست را جویده و زخم سمت چپ حاصل از پانسمان 1 % می باشد و زخم سمت راست زخم کنترل می باشد که عفونت کرده است. -تصویر 6 زخم حاصل از پانسمان 0% دارای مقدار کمی عفونت خشک شده تصویر 7- قرار گیری جدید پانسمان 0 % روی زخم روز هفتم : -تصویر 8زخم حاصل از پانسمان صفر درصد -تصویر 9زخم حاصل از پانسمان 1 % -تصویر 10موش دوم ، سمت چپ کنترل و سمت راست 1 % تصویر 11-زخم 8% موش سوم ، در اثر تعویض پانسمان مجددا مقداری زخم شد -تصویر 12زخم کنترل موش سوم تصویر 13- زخم کنترل موش چهارم روز دهم: تصویر 14 - زخم کنترل حاوی مقداری عفونت تصویر 15-زخم حاصل از پانسمان 1% -تصویر 16موشی که رینگ های سیلیکونی پشتش را حدودا کنده بود- زخم سمت چپ کنترل و زخم سمت راست 8 % . محاسبات انجام شده با نرم افزار Image j به شرح زیر می باشد : تست آنتی باکتریال : تصویر 17- استافیلوکوکوس اورئوس (گرم مثبت) تصویر 18- اشرشیا کلی (گرم منفی) بحث و نتیجه گیری ساخت داربست ها با استفاده از دستگاه الکتروریسی ، روشی جدید برای ساخت پانسمان های جدید می باشد که بتوان از طریق آن ، مواد دارویی را به صورت الیاف دراورد.در این مطالعه از دستگاه الکترواسپینینگ به دلیل اینکه ماهیت مواد مورد استفاده از لحاظ هیدروفوبیسیته متفاوت بود ، به صورت دو محوره استفاده شد ، که امروزه خیلی کم به این صورت الکتروریسی میگردد. یکی از نوآوری های این طرح اضافه شدن ماده ی DACC به ماده ی PCL بود که سبب نازک تر شدن نانو الیاف شد. در این مطالعه برای زخم موش ها از الگوی زخمی استفاده شد که تا پیش از این ، زخم ها به طور خیلی معمولی و ساده ایجاد می گشت.اما در این مطالعه با استفاده از رینگ سیلیکونی و بخیه زدن آن به پوست موش ،الگویی مورد استفاده قرار گرفت که ، در مقالات چاپ شده در مجله ی Nature به چاپ رسیده است. در این مطالعه که به صورت تجربی و آزمایشگاهی صورت گرفت ، علاوه بر طراحی و ساخت ، تست های تکمیلی جهت مقایسه با سایر پانسمان ها انجام شد. این پانسمان ، به نسبت سایر پانسمان های دیگر که قبل از استعمال آن ، از آنتی بیوتیک و مواد آنتی سپتیک استفاده میشود ، با توجه به اینکه خواص آنتی باکتریال نیز دارد ، به دلیل وجود خاصیت فیزیکی و غیر فعال سازی باکتری های پاتوژن زخم با جذب آنها ، مقاومت درمانی را کاملا در درمان زخم ها حذف کرده است. در مقایسه با سایر پانسمان های موجود در بازار ، از لحاظ کارایی و هزینه ، این پانسمان در صورت تولید انبوه ، از لحاظ هزینه به صرف تر میباشد.

خلاصه نتایج حاصله

در این آزمایش پس از بررسی 18 تنظیم مختلف بر روی دستگاه الکترو اسپینینگ ، در نهایت بهترین تنظیم جهت الکتروریسی به دست آمد.در این مطالعه برای به دست آوردن نانو الیاف یک دست تر و منظم تر ، به جای کلروفرم و DMF از اسید استیک گلاسیال استفاده کردیم و الیاف بسیار یک دست تر و نازک تر گشت و در مقایسه با داربست های دیگر نتایج بهتری را ثبت کرد. بر اساس بررسی های انجام شده در این تحقیق جذب عفونت و دبریدیمان زخم به پانسمان ، همچنین بهبود زخم موش ها مشاهده شد.پس از بررسی تست آنتی باکتریال ، باکتری استافیلوکوک اورئوس به پانسمان با غلظت های 8% و 1% به ترتیب بیشترین حساسیت را نشان داد ، اما در برابر پانسمان 0% مقاومت داشت و رشد کرد.باکتری E.Coil نسبت به این پانسمان مقاوم بود.در این آزمایش درصد زیست پذیری سلول های Wehi و تعداد آنها در برابر تاثیر عصاره پانسمان کاهش یافت. نتایج به دست آمده از بررسی توانایی زیستی رده سلول Wehi به روش MTT : جدول شماره 2 : مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی رده سلول wehi پس از تاثیر غلظت های متفاوت پانسمان طی 72 ساعت به روش رنگ سنجی MTT MTT- wehi Group 72h Time 15.67 0% 9.94 1% 11.56 8% در آزمایش ایجاد زخم بر روی موش در هر بار تعویض پانسمان از زخم موش تصویر برداری شد و مساحت آن با استفاده از نرم افزار Image J محاسبه و تحلیل گشت. عکس برداری از زخم ها به شرح ذیل می باشد: روز اول : تصویر اول control , 1% concentration روز سوم: -تصویر 2زخم حاصل از پانسمان 1 % تصویر 3-زخم کنترل تصویر 4- زخم با پانسمان 8 % که پانسمان روی زخم می باشد و مقداری از دبریدیمان زخم را جذب کرده است -تصویر 5 زخم دارای پانسمان 0 % در تصویر فوق مشاهده می شود که موش شماره ی 2 رینگ سیلیکونی سمت راست را جویده و زخم سمت چپ حاصل از پانسمان 1 % می باشد و زخم سمت راست زخم کنترل می باشد که عفونت کرده است. -تصویر 6 زخم حاصل از پانسمان 0% دارای مقدار کمی عفونت خشک شده تصویر 7- قرار گیری جدید پانسمان 0 % روی زخم روز هفتم : -تصویر 8زخم حاصل از پانسمان صفر درصد -تصویر 9زخم حاصل از پانسمان 1 % -تصویر 10موش دوم ، سمت چپ کنترل و سمت راست 1 % تصویر 11-زخم 8% موش سوم ، در اثر تعویض پانسمان مجددا مقداری زخم شد -تصویر 12زخم کنترل موش سوم تصویر 13- زخم کنترل موش چهارم روز دهم: تصویر 14 - زخم کنترل حاوی مقداری عفونت تصویر 15-زخم حاصل از پانسمان 1% -تصویر 16موشی که رینگ های سیلیکونی پشتش را حدودا کنده بود- زخم سمت چپ کنترل و زخم سمت راست 8 % . محاسبات انجام شده با نرم افزار Image j به شرح زیر می باشد : تست آنتی باکتریال : تصویر 17- استافیلوکوکوس اورئوس (گرم مثبت) تصویر 18- اشرشیا کلی (گرم منفی)

فایل های پژوهش