پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

مقدمه و بیان مسئله . سرطان معده، بیماری شیوع بسیار بالایی دارد. این سرطان چهارمین بدخیمی شایع است سلولهای بنیادی سرطانی (CSCs) زیر گروهی از سلولهای سرطانی می باشند که ویژگیهایی شبیه سلولهای بنیادی دارند؛ و توانایی ایجاد انواع سلولهایی که در یک نمونه سرطان موجودند را دارا هستند. CSCs، دارای ویژگی خود تجدید کنندگی هستند. ازطرفی CSCs، تومورژنیک هستند. CSCs رشد و متاستاز سرطان را پیش می برند. وجود CSCs، مسئول مقاومتهای درمانی شیمیایی و پرتویی است و منجر به شکست درمانهای معمول سرطان می گردند. مقاومتهای درمانی منجر به عود مجدد سرطان و متاستاز سلولهای سرطانی به مناطق دیگری از بدن میگردند. گفته میشود CSCs با ساز و کارهایی که دارند عامل مقاومت به درمان، عود و متاستاز سرطانها هستند برای بررسی نقش این سلولها در ایجاد مقاومت به داروی شیمی درمانی DOCدر سرطان معده، سلول های رده MKN-45 را ابتدا با این دارو در غلظتها و زمانهای مختلف تیمار نموده و سپس میزان CD44 به عنوان مارکر سلولهای بنیادی سنجیده میشود. سپس میزان بیان ژنهای دخیل در مقاومتهای دارویی MiR-34a، miR-451، miR-21 ، CXCR4، MDR-1 و SIRT1 با PCR Real time بررسی میشوند. در نهایت ارتباط احتمالی موجود بین میزان بیان این ژنها در رده سلول سرطانی MKN-45 و سلول های باقیمانده از دارو مقایسه می شوند؛ اهمیت ونو آوری انجام این پژوهش در این است که اگر مشخص شود، بیشترین سلولهای باقیمانده پس از تیمارهای دارویی CSCs هستند، میزان بیان ژنهای مطرح شده بررسی و مقایسه میشوند تا مسیر مولکولی اصلی ایجاد کننده مقاومت بدست آید. روش اجرا کشت سلول و MTT assay: سلولهای MKN-45 نوعی سلول چسبان از منشا تومور معده است. رده سلولی MKN-45 از مرکز انی سی توپاستور ای ران تهی ه خواهد شد. ای ن رده سلولی به صورت تک لای ه در محی ط کشت DMEM حاوی 10%FBS ، 100 U/ml penicillin ،100 µg/ml streptomycin و Glutamineو در شرای ط انکوباتور با دمای 37 درجه و 5 درصد CO2کشت داده می شود. جهت بررسی اثر داروی (DOC) بر سلولهای MKN-45 در تست های مختلفی که در ادامه به آنها اشاره شده است ابتدا لازم است که تست MTT assay انجام شود و IC25 و IC50 / IC75 و IC90 که نشان دهنده غلظتی از دارو است که باعث کشتن درصد متفاوت سلولها می شود، در بازه زمانی مناسب به دست آی د. تا در نهای ت بهتری ن زمان و غلظت دارو بدست آی د. بدی ن منظور سلولها به تعداد مناسب در پلی ت های کشت 96 چاهکی کشت داده می شوند. 24 ساعت بعد، دوزهای مختلفی از داروی شی می درمانی به صورت جداگانه در غلظت های افزای ش ی ابنده با نسبت ثابت هر کدام از داروها به چاهک های مربوطه اضافه می شوند و تعدادی از چاهک ها که دارو به آنها اضافه نشده است به عنوان کنترل استفاده می شوند. 48 ساعت بعد تست MTT assay انجام خواهد شد. جهتMTT assayاز کی ت Cell Titer 96 Aqueous one solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega) و بر اساس پروتکل شرکت سازنده استفاده خواهد شد. اساس ای ن کی ت آن است که ماده شی می ائی MTT توسط سلولهای زنده جذب شده و به محصول رنگی دارای جذب نوری در 450 نانومتر تبدی ل می گردد. شدت جذب نوری در هر چاهک بی انگر تعداد سلولهای زنده آن خواهد بود. نتای ج به کمک اسپکتروفوتومتری قرائت می شود و غلظتی از دارو که باعث کشتن درصدهای مختلف سلولها نسبت به سلولهای کنترل می شود به عنوانIC های مختلف گزارش می شود.2- بررسی می زان سلولهای CD44+ پس از تی مار سلولها در IC های مختلف: با استفاده از آنتی بادی ( monoclonal antibody against human CD44 ) می زان سلولهای CD44+ با دستگاه فلوسای تومتری بدست خواهد آمد.3- Real Time PCR: RNA کل سلولها در گروههای مختلف با استفاده از کی ت استخراج RNA ازسلول ها استخراج شده و به cDNA تبدی ل خواهد شد. پس از طراحی و تهی ه پرای مرها از روش Real- Time PCR برای اندازه گی ری بی ان استفاده خواهد شد. در تمامی واکنشهای Real-Time PCR از کنترل منفی استفاده خواهد شد. U6 و GAPDH ژن رفرانس در نظر گرفته شده اند. پس از تهی ه منحنی استاندارد از روش Pfaffle برای آنالی ز داده ها استفاده می شوند. در نهایت تغی ی ر الگوی بیان مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهد گرفت. یافته ها یافته های حاصل و بدست امده نشان داد بحث و نتیجه گیری مطالعات بر روی سلول هایبنیادی سرطانی،حاکی ازوبژگی های مهم و خاص این سلول ها در پیش آگهی بیمارانو مقاومت به درمان های معمول از جمله شیمی درمانی و پرتو درمانی میباشد.علاوه بر این نشان داده شده که مسیرهای پیام رسانی خاصی در خودبازسازی و تمایز سلول های بنیادی نقش دارند و مکانیسمهای فرار این سلول ها از درمان های رایجدر حال مشخص شدن هستند

خلاصه نتایج حاصله

بررسی می زان سلولهای CD۴۴+ پس از تی مار سلولها در IC های مختلف: با استفاده از آنتی بادی ( monoclonal antibody against human CD۴۴ ) می زان سلولهای CD۴۴+ با دستگاه فلوسای تومتری بدست خواهد آمد.۳- Real Time PCR: RNA کل سلولها در گروههای مختلف با استفاده از کی ت استخراج RNA ازسلول ها استخراج شده و به cDNA تبدی ل خواهد شد. پس از طراحی و تهی ه پرای مرها از روش Real- Time PCR برای اندازه گی ری بی ان استفاده خواهد شد. در تمامی واکنشهای Real-Time PCR از کنترل منفی استفاده خواهد شد.

فایل های پژوهش