پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

علاوه بر تغیرات ژنتیکی، تغییرات اپی ژنتیک نیز یک نقش قابل توجه ای را در ترانس فورمیشن سلول های بدخیم بازی می کنند. شواهد زیادی وجود دارد که نشان می دهد که استیلاسیون فاکتورهای رونویسی، مستقل از تغییرات هیستون ها، یک نقش حیاتی در تومورزایی و متعاقباً در مقاومت دارویی دارد. sirtuinها کلاس III از HDACها می باشند که با داستیله کردن پروتئین های هیستونی، کروماتین را از نظر رونویسی به شکل غیرفعال در می آورند. اخیرا پیشنهاد شده است که sirtuinها، به ویژه SIRT-۱ نقشی را در leukemogenesis بازی می کند. نشان داده شده است که SIRT-۱ در AML و B-cell chronic lymphocytic leukemia افزایش بیان دارد و در طی تمایز نوتروفیل های سلولهای APL تنظیم کاهشی می یابد. SRIT-۱ مستقیماً پروتئین سرکوبکر تومور P۵۳ را داستیله و در نتیجه باعث غیرفعال شدن TP۵۳ می گردد. علاوه بر این، SIRT-۱ با دخالت کردن در فعالیت خانواده FOXO از فاکتورهای رونویسی، BAX، Rb و E۲F۱، مانع آپوپتوزیس سلول ها در پاسخ به آسیب و استرس می گردد.برای نرمال سازی مقادیر کمی mRNA در نمونه‎های کنترل و تست، از ژن بتا اکتین به عنوان ژن رفرانس استفاده شد. در این مطالعه ژن‎های Bax و BCL2 و ژن بتا اکتین با استفاده از SYBR® Green Real-Time PCR Master Mix و دستگاه Corbett 3000 تکثیر (مراحل انجام Real time PCR طبق جدول شماره 2 انجام گرفت) و بیان mRNA هر ژن نسبت به ژن رفرانس به روش آستانه نسبی یا 2 –ΔΔCt تجزیه و تحلیل شد. به این صورت که ابتدا ΔCT ژن هدف در هر نمونه از افتراق CT ژن هدف و CT ژن GAPDH به عنوان ژن رفرانس محاسبه شد و سپس با افتراق ΔCT هر نمونه از نمونه کنترل ΔΔCT بدست آورده شد و بعد از آن 2 –ΔΔCt محاسبه گردید و در آخر با استفاده از نرم افزار SPSS آنالیز شد.نمودار شماره 8: بررسی میزان بیان ژن BCL2 در گروه‎های مختلف تیمار در مقایسه با گروه کنترل پس از 6 ساعت از تیمار سلولی. تاثیر غلظت‎های مختلف ATO، غلظت IC50 Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 Tenovin-6 با غلظت‎های مختلف ATO بر روی میزان بیان ژن‎ آنتی‎آپوپتوتیک BCL2 پس از 24 ساعت از تیمار سلولی: پس از 24 از تیمار سلولی، بیان ژن BCL2 به جزء در غلظت 5/0 میکرومولار ATO، در بقیه گروه‎های تیمار در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی دار نشان می‎دهد (05/0 > p value) (نمودار شماره 9) . نمودار شماره 9: بررسی میزان بیان ژن BCL2 در گروه‎های مختلف تیمار در مقایسه با گروه کنترل پس از 24 ساعت از تیمار سلولی. بحث و نتیجه گیری افزایش بیان پروتئین SIRT1 در انواع مختلف بدخیمی‎های هماتولوژیکی گزارش شده است (39-37). مطالعات اخیر نشان می‎دهد که مهار SIRT1 می‎تواند در درمان بیماران مبتلاء به بدخیمی‏های بافت خونساز کمک کننده باشد. برای مثال گزارش شده است که مهار SIRT1 در رده سلولی K562 باعث القاء آپوپتوز و مهار رشد این سلول‏‎ها می‎شود (40). همچنین نشان داده شده است که مهار SIRT1 در ترکیب با داروی Imatinib (دارویی که به طور روتین برای درمان بیماران مبتلاء به CML مورد استفاده قرار می‎گیرد) باعث حذف سلول‎های بنیادی لوکمیایی در مدل‎های حیوانی می‎شود (41). نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان داد Tenovin-6 اثرات کشندگی ATO و القاء آپوپتوز را بر روی سلول‎های سرطانی NB4 تقویت می‎کند.

خلاصه نتایج حاصله

یزان زیست‌پذیری سلول‎های NB4 تحت تاثیر داروی Tenovin-6 سلول‎های NB4 به تعداد 104 سلول در پلیت 96 خانه سیت شده و سپس با دوزهای مختلف Tenovin-6 به مدت 24، 48 و 72 ساعت تیمار شدند. سلول‎های کنترل بدون دارو برای مقایسه با سلول‎های تیمار شده با دارو و همچنین کنترل بدون سلول (Tenovin-6، MTS و محیط) به منظور بررسی اثرات داخلی Tenovin-6 و MTS در نظر گرفته شد. نتایج سنجش رنگ MTS با اندازه‎گیری جذب نوری (OD) بر اساس غلظت‎های Tenovin-6 مورد استفاده در مقایسه با میزان تکثیر سلولی به صورت رسم نمودار بدست آمد. نتابج با استفاده از آنالیز آماری بدست آمد و نمودارها اثر Tenovin-6 را پس از 24، 48 و 72 ساعت بر روی سلول‎ها نشان می‎دهند. نمودارها بیانگر این هستند که اثر مهارکنندگی Tenovin-6 روی سلول‎های NB4 وابسته به دوز دارو و زمان است. نتایج زیست‎پذیری سلول‎های NB4 پس از اثر داروی Tenovin-6 در 24، 48 و 72 ساعت با روش MTS: همانطور که در نمودار شماره 1 نشان داده شده است پس از 24، 48 و 72 ساعت از تیمار سلول‎های NB4 با غلظت‎های مختلف Tenovin-6، با افزایش غلظت دارو درصد سلول‎های زنده کاهش یافته است و غلظتی از دارو که منجر به مهار 50 درصد رشد سلول‎ها (میزان IC50) می‎شود با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون Probit به ترتیب 9، 4 و 2 بدست آمد. نمودار شماره 1: درصد زیست‎پذیری سلول‎های NB4 پس از 24، 48 و 72 ساعت از تیمار با مقادیر مختلف Tenovin-6 به روش MTS. Tenovin-6 اثرات وابسته به دوز و زمان را نشان می‎دهد. میزان زیست‌پذیری سلول‎های NB4 تحت تاثیر سه دوز مشخص داروی ATO و تحت تاثیر ترکیب دو داروی ATO و Tenovin-6 سلول‎های NB4 به تعداد 104 سلول در پلیت 96 خانه سیت شده و سپس با دوزهای 5/0، 1 و 2 میکرومولار آرسنیک و همچنین با غلظت IC50 داروی Tenovin-6 و سه دوز آرسنیک به صورت ترکیبی به مدت 24 و 48 ساعت تیمار شدند. سلول‎های کنترل بدون دارو برای مقایسه با سلول‎های تیمار شده با دارو در نظر گرفته شد. همانطور که در نمودارهای شماره 2 و3 نشان داده شده است تیمار سلول‎های NB4 با دوزهای مختلف ATO دارای اثرات کشندگی وابسته به دوز و زمان است. همچنین تیمار سلول‎های NB4 با غلظت IC50 داروی Tenovin-6 و دوزهای مختلف ATO بصورت ترکیبی به مدت 24 و 48 ساعت، اثرات کشندگی ATO را تقویت می‎کند. نمودار شماره 2: درصد زیست‏‎پذیری سلول‎های NB4 پس از 24 ساعت مجاورت با دوزهای 5/0، 1 و 2 میکرومولار آرسنیک، دوز IC50 داروی TV6 و ترکیب دوز IC50 داروی TV6 با سه دوز مشخص ATO. نمودار شماره 3: درصد زیست‏‎پذیری سلول‎های NB4 پس از 48 ساعت مجاورت با دوزهای 5/0، 1 و 2 میکرومولار آرسنیک، دوز IC50 داروی TV6 و ترکیب دوز IC50 داروی TV6 با سه دوز مشخص ATO. نتایج تعیین میزان مرگ سلولی القاء شده در سلول‎های NB4 به روش فلوستومتری: سلول‎های NB4 به تعداد 105 × 2 سلول در هر چاهک از پلیت 6 خانه کشت داده شد و پس از 24 ساعت انکوباسیون، با غلظت‎های مختلف دارو (سه دوز تکی 5/0، 1 و 2 میکرومولار آرسنیک، دوز IC50 داروی Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 داروی Tenovin-6 با دوزهای مختلف آرسنیک) مجاور گردید و پس از 24 و 48 ساعت انکوباسیون با رنگ‏های Annexin V و PI برای بررسی فلوسیتومتری رنگ‎آمیزی گردید. همانطور که درنمودار‎های 4 و 5 نشان داده شده است داروی ATO به تنهایی در دوز 2 میکرومولار پس از 24 و 48 ساعت، به طور قابل توجه‎ای در مقایسه با کنترل، مرگ سلولی را القاء می‎کند. همچنین مرگ سلولی القاء شده توسط دوزهای مختلف آرسنیک توسط داروی Tenovin-6 تقویت می‎شود. نمودار شماره 4: میزان القاء مرگ سلولی در سلول‎های NB4 پس از 24 ساعت مجاورت با غلظت‎های مختلف دارو در مقایسه با سلول‎های کنترل. نمودار شماره 5: میزان القاء مرگ سلولی در سلول‎های NB4 پس از 48 ساعت مجاورت با غلظت‎های مختلف دارو در مقایسه با سلول‎های کنترل. نتایج Real time PCR: پس از اتمام واکنش، با انتخاب گزینه Threshold دستگاه به صورت خودکار خط Threshold را رسم کرده و نقطه‎ای که خط Threshold منحنی را قطع کرده، به عنوان CT (سیکلی را که در آن خط Threshold منحنی PCR را قطع می‎کند Threshold Cycle می‎گوییم) منحنی در نظر گرفته شد. برای بدست آوردن ΔCT، CT ژن هدف هر نمونه از CT ژن بتا اکتین کسر گردید، پس از آن ΔΔCT (که تفاضل ΔCT تمام نمونه‎ها از ΔCT نمونه کنترل) و 2-ΔΔCT محاسبه گردید. تاثیر غلظت‎های مختلف ATO، غلظت IC50 Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 Tenovin-6 با غلظت‎های مختلف ATO بر روی میزان بیان ژن‎ پرو‎آپوپتوتیک BAX پس از 6 ساعت از تیمار سلولی: همانطور که در نمودار شماره 6 نشان داده شده است بیان ژن BAX پس از 6 ساعت از تیمار سلولی در هیچ کدامیک از گروه‎های تیمار در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنی‎داری را نشان نمی‎دهد. نمودار شماره 6: بررسی میزان بیان ژن BAX در گروه‎های مختلف در مقایسه با گروه کنترل پس از 6 ساعت از تیمار سلولی. تاثیر غلظت‎های مختلف ATO، غلظت IC50 Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 Tenovin-6 با غلظت‎های مختلف ATO بر روی میزان بیان ژن‎ پرو‎آپوپتوتیک BAX پس از 24 ساعت از تیمار سلولی: پس از 24 از تیمار سلولی، بیان ژن BAX به جزء در غلظت 5/0 میکرومولار ATO در بقیه گروه‎های تیمار در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنی دار نشان می‎دهد (05/0 > p value) (نمودار شماره 7) . نمودار شماره 7: بررسی میزان بیان ژن BAX در گروه‎های مختلف در مقایسه با گروه کنترل پس از 24 ساعت از تیمار سلولی. تاثیر غلظت‎های مختلف ATO، غلظت IC50 Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 Tenovin-6 با غلظت‎های مختلف ATO بر روی میزان بیان ژن‎ آنتی‎آپوپتوتیک BCL2 پس از 6 ساعت از تیمار سلولی: همانطور که در نمودار شماره 8 نشان داده شده است بیان ژن BCL2 پس از 6 ساعت از تیمار سلولی به جزء در غلظت 2 میکرومولار ATO، در هیچ کدامیک از گروه‎های تیمار در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی‎داری را نشان نمی‎دهد. نمودار شماره 8: بررسی میزان بیان ژن BCL2 در گروه‎های مختلف تیمار در مقایسه با گروه کنترل پس از 6 ساعت از تیمار سلولی. تاثیر غلظت‎های مختلف ATO، غلظت IC50 Tenovin-6 و ترکیب دوز IC50 Tenovin-6 با غلظت‎های مختلف ATO بر روی میزان بیان ژن‎ آنتی‎آپوپتوتیک BCL2 پس از 24 ساعت از تیمار سلولی: پس از 24 از تیمار سلولی، بیان ژن BCL2 به جزء در غلظت 5/0 میکرومولار ATO، در بقیه گروه‎های تیمار در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی دار نشان می‎دهد (05/0 > p value) (نمودار شماره 9) . نمودار شماره 9: بررسی میزان بیان ژن BCL2 در گروه‎های مختلف تیمار در مقایسه با گروه کنترل پس از 24 ساعت از تیمار سلولی.

فایل های پژوهش