پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

سرطان پروستات بعد از سرطان ریه دومین علت مرگ‌ومیر در میان مردم در آمریکا می‌باشد و این بیماری در دو دهه گذشته در آسیا افزایش شیوع داشته است ADDIN EN.CITE Rasul20138(1)8817Rasul, AzharDi, JunMillimouno, Faya MartinMalhi, MahadevTsuji, IchiroAli, MuhammadLi, JiangLi, XiaomengMoleculesMolecules9382-93961882013. سرطان پروستات همچنین رایج‌ترین تومور شناخته‌شده در مردان در کشورهای صنعتی است. هنگامی‌که رویکرد به سمت تولید داروهای ضد سرطان مشتق از گیاه تغییر پیدا می‌کند، مشکلات بیشتری به وجود می‌آیند. ازآنجایی‌که بسیاری از گیاهان دارویی بر اساس توصیف پرونده‌های پزشکی قدیمی به‌عنوان فعالیت‌های ضد سرطانی فرض شده‌اند، ضروری است که مطالعات فارماکولوژیک و بیولوژیکی جدی‌تری برای اثبات اثربخشی آن‌ها انجام شود. به همین علت، تنها چند دارو با پایه گیاهی تولید می‌شود که در حال حاضر در بازار برای درمان سرطان‌های انسان موجود است. Cucurbitacins به گروهی از tetracyclic triterpenes اشاره می‌کند که ابتدا در خانواده گیاه Cucurbitaceae شناسایی‌شده است. در طب سنتی، گیاهان حاوی cucurbitacin برای فعالیت‌های ضد تب، ضد درد، ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد تومور شناخته‌شده‌اند. در حال حاضر 12 دسته اصلی برای گروه cucurbitacins و مشتقات آن‌ها با توجه به تنوع زنجیره جانبی آن‌ها وجود دارد. این ترکیب به‌طور وسیعی در گیاهان مختلف (ازجمله کدو) یافت می‌شوند. Cucurbitacins مانند سایر مواد مشتق شده از گیاه باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیکی و فیزیولوژیک در سلول‌های سرطانی می‌شود. با توجه به اینکه مطالعه‌ای درزمینه‌ی بررسی اثرات ژنوتوکسیسیتی ترکیب Cucurbitacin B بر روی این سلول‌ها انجام‌نشده و نظر به اینکه مشخص شدن دوز مناسب این ترکیب که فاقد اثرات ژنوتوکسیسیتی است ( جهت عدم آسیب‌رسانی به سلول‌های طبیعی بدن ) در رژیم غذایی حائز اهمیت است از طرف دیگر جهت انجام آزمون کامت اسی نیاز به داشتن IC50 ترکیب موردمطالعه داریم (هرچند این مهم از طریق مقالات بدست خواهد آمد ولیکن به علت تعدد نتایج IC50 در مقالات و اینکه این اعداد نسبت به درجه خلوص ترکیب موردبررسی و شرکت سازنده آن مورد اعتماد نمی‌باشد نیاز به سنجش IC50 ترکیب موردمطالعه در همین پروژه احساس می‌شود ) لذا این مطالعه باهدف بررسی اثرات ژنوتوکسیک، سیتوتوکسیک و القاء آپوپتوز ترکیب طبیعی Cucurbitacin B در رده سلولی PC3 انجام می‌شود.

خلاصه نتایج حاصله

سلول‌های PC3 از انستیتو پاستور خریداری شدند و در محیط RPMI 1640 که حاوی 10%سرم جنین گاو،پنی‌سیلین(Ml/u100)،استرپتومایسین(g/mlµ100) بود، کشت داده شدند و در انکوباتور37درجه با5% CO2 و رطوبت 95% نگهداری شدند. غلظت‌های مختلف Cu B در DMSO حل شد و به سلول‌های کشت داده‌شده در محیط کشت کامل اضافه شد. به‌عنوان کنترل در کشت سلولی در محیط کشت کامل DMSOبه‌تنهایی اضافه شد. به‌منظور بررسی میزان فعالیت زیستی سلول‌ها به روش MTT تعداد 5000 سلول PC3 کشت داده‌شده در محیط RPMI حاوی 10 درصد FBS را در هر یک از چاهک‌ها پلیت 96 خانه کشت داده، و اجازه می‌دهیم تا سلول‌ها به کف پلیت چسبیده و به حالت پایدار خود درآیند. سپس سلول‌ها در مجاورت با غلظت‌های مختلف از Cucurbitacin B قرار می‌گیرند و بعد از انکوباسیون به مدت 24، 48 ساعت، میزان فعالیت زیستی به روش MTT محاسبه شد بعد از بدست آوردن IC50 ترکیب موردنظر، جهت بررسی القاء آپوپتوز و چرخه سلولی بر روی غلظت IC50 و دو غلظت پایین‌تر از آن با استفاده از Annexin و PI ( بررسی آپوپتوز) و رنگ PI (چرخه سلولی) فلوسیتومتری انجام گرفت. به‌طور خلاصه تعداد 100 هزار سلول در هر چاهک از پلیت 6 خانه کشت داده شد و بعد از مجاورت با غلظت‌های بدست آمده به مدت 48 ساعت انکوبه شد. سلول‌ها بعد از تریپسینه کردن، با بافر موجود در کیت شستشو داده‌شده و درنهایت به مقدار 5 میکرو لیتر از Annexin V-FITC و PI به هر نمونه (100 هزار سلول در 100 میکرولیتر) اضافه‌شد و بعد از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی و در دمای اتاق توسط دستگاه فلوسایتومتری موردبررسی قرار گرفتند و میزان آپوپتوز و نکروز سلول‌ها بررسی شد. به‌منظور بررسی چرخه سلولی نیز، بعد از شستشو و نفوذپذیر کردن سلول‌ها، بارنگ PI رنگ‌آمیزی و بعد از 2 ساعت انکوباسیون توسط دستگاه فلوسایتومتری بررسی شد. با استفاده از پروتکل موجود، آزمون کامت اسی (الکتروفورز قلیایی ) انجام شد. هر نمونه سه بار مورد آزمایش قرار گرفت. حداقل تعداد 100 تصویر سلولی را برای هر غلظت ( زمان 48 ساعت) و با استفاده از نرم‌افزار SCAP موردسنجش قرار گرفت. پس از تعیین 50IC و بقاء سلولی ( Survival cells) در یک پلیت 6 خانه کشت سلولی ، در هر خانه به تعداد 100000 سلول از سلول‌های PC3 ریخته و سلول‌ها را تحت تأثیر غلظت 50IC (به‌دست‌آمده از نتایج MTT به مدت48 ساعت) قرار دادیم. پس‌ازآن سلول‌ها جمع‌آوری‌شده و برای مراحل بعدی و انجام آزمون الکتروفورز قلیایی (کامت اسی ) مورداستفاده قرار گرفتند.در این آزمایش از سلول‌های PC3 تیمار نشده به‌عنوان نمونه‌های کنترل منفی و نمونه‌های کنترل مثبت شامل سلول‌های PC3 تیمار شده با غلظت Mµ50 از H2O2 استفاده شد. بعد از آماده کردن اسلایدها و قرار دادن سلول‌ها در آگاروز موجود بر روی لام ها، اسلایدها به مدت یک‌شب در محلول لیز کننده که شامل نمک و دترجنت های زیادی است قرار داده شد. اسلایدها در محلول با 13< PH که همان محلول الکتروفورز است قرار گرفتند. بعد از انجام الکتروفورز و خنثی‌سازی، اسلایدها با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شده و با استفاده از میکروسکوپ فلورسانت موردبررسی قرار گرفتند معمولاً از عدسی x 40 برای مشاهده DNA و کامت استفاده می‌شود. بعد از جمع‌آوری عکس‌های مناسب، میزان دم و سر کامت های تشکیل‌شده با استفاده از نرم‌افزار محاسبه شد و گروه‌های مختلف مورد مقایسه قرار گرفتند.

فایل های پژوهش