پژوهشگر

همکاران پژوهشگر

چکیده پژوهش

در بررسی میزان سمیت سلولی (با بررسی IC50) نانوذرات تهیه شده حاوی هر دارو نسبت به داروی آزاد در سلول‌های 4T1 با استفاده از تست Resazurin در 48 ساعت مشخص شد که میزان سمیت نانوذرات بارگیری شده با هر دارو در همه گروه‌های تکی و ترکیبی به‌دست‌آمده بیشتر از داروهای آزاد و معنادار بوده است. همچنین آپوپتوز سلول‌های 4T1 که با نانوذرات بارگیری شده با داروها و داروهای آزاد در 48 ساعت تیمار شده بودند به روش فلوسایتومتری FCM و پروتکل FACS مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان می‌دهد که داروهای آزاد تأثیرات بسیار کمتری بر آپپتوز و نکروز سلول‌های 4T1 نسبت به نانوذرات بارگیری شده با هر دارو دارد. نتایج مطالعات مرگ سلولی با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری نشان می‌دهد که درصد سلول‌های آپوپتوتیک در نانوذرات بارگیری شده با داروها نسبت به داروهای آزاد افزایش‌یافته که این نتایج تأثیر معنادار استفاده از نانوذرات MSN برای دارورسانی را تأیید کرده است. به‌طورکلی نتایج سمیت سلولی و آپوپتوز نشان می‌دهد که درمان به‌صورت ترکیبات دوتایی داروها چه به‌صورت آزاد و چه به‌صورت بارگیری شده در نانوذرات نسبت به درمان تکی به‌صورت معنادار و چشمگیری باعث افزایش اثر داروها می‌گردد. برای Real-Time PCR در ابتدا RNA سلول‌ها با استفاده از کیت مربوطه به استخراج RNA استخراج شد و پس از استخراج RNA، نمونه‌ها aliquot شد و غلظت RNA توتال سنجش شد و تا جمع‌آوری کل نمونه‌ها، در -70 درجه قرار داده شد. اندازه‌گیری میزان RNA توتال: با استفاده از دستگاه نانودراپ غلظت RNA توتال اندازه‌گیری شد. برای این کار RNA به نسبت 1 به 100 رقیق شده و در طول موج‌های 260، 280 و 320 میزان جذب آن قرائت شد. برای تبدیل RNA به cDNA از کیت Revert Synthesis Aid First cDNA استفاده‌شده و سپس با انجام Real TimePCR با استفاده از پرایمرهای مناسب هر ژن میزان mRNA ژن‌ها به‌دست‌آمده و با استفاده از روش CT∆∆ میزان mRNA هر ژن نسبت به ژن رفرنس GAPDH مقایسه شد. منحنی ذوب برای هر واکنش مورد بررسی قرار گرفت تا خلوص محصولات چک گردد. پرایمرهای مورداستفاده: پرایمرهای مورداستفاده برای ژن VEGF: پرایمر Forward: TGTGTTGGGAGGAGGATGTC پرایمر Reverse: GTTTGTCGTGTTTCTGGAAGTGA پرایمرهای مورداستفاده برای ژن HIF-1alpha: پرایمر Forward: CCACAACTGCCACCACTGA پرایمر Reverse: GCCACTGTATGCTGATGCCTT

خلاصه نتایج حاصله

میزان و مقایسه میزان زنده‌مانی سلول‌های 4T1 در مجاورت با داروها و نانوذرات بارگیری شده با داروها (MSN@Drugs) به‌صورت تکی و ترکیبی پس از 48 ساعت نتایج نشان داد که تیمار سلول‌های 4T1 با ترکیبات دارویی به‌صورت دوتایی در 48 ساعت نسبت به تیمارهای تکی سه‌تایی داروها اثرات بیشتری در مهار رشد سلولی داشتند. همچنین تیمار سلول‌ها با نانوذرات حاوی داروها نسبت به داروهای آزاد، هم به‌صورت ترکیبی و هم به‌صورت تکی نسبت اثرات چشمگیرتری در مهار رشد سلولی به‌صورت معنادار نشان دادند (p value < 0.0001). به‌طورکلی ترکیبات دوتایی EVE-5FU و 5FU-LiCl هم به‌صورت آزاد و هم به‌صورت بارگیری شده در نانوذرات باعث افزایش مرگ سلولی به‌صورت معنادار شدند(p value < 0.0001). نمودار 1: مقایسه درصد زیست پذیری سلول‌های 4T1 پس از 48 ساعت مجاورت با IC50 داروهای اورولیموس، 5-فلورواوراسیل و لیتیوم کلرید و نانوذرات مزوپوروس سیلیکای بارگیری شده با هر دارو به‌تنهایی و ترکیب‌های مختلف دوتایی و سه‌تایی با روش Resazurin. هر گروه حداقل 3 بار تکرار شده است (mean ± SD). نتایج میزان القاء آپوپتوز در سلول‌های 4T1 تیمار شده با گروه‌های مختلف پس از 48 ساعت به روش فلوسیتومتری سلول‌ها پس از مجاورت با داروها و نانوذرات مزوپوروس سیلیکای حاوی دارو به‌صورت تکی و ترکیبی به مدت 48 ساعت در انکوباتور CO2 قرار داده شدند و سپس با رنگ‌های Annexin V و PI برای بررسی فلوسیتومتری رنگ‌آمیزی گردیدند. نمودار2 میزان آپوپتوز القاشده توسط داروهای اورولیموس، 5-فلورواوراسیل و لیتیوم کلرید را به‌تنهایی و در ترکیب با یکدیگر نشان می‌دهد و نمودار 3 میزان آپوپتوز القاشده توسط نانوذرات حاوی اورولیموس، 5-فلورواوراسیل یا لیتیوم کلرید را به‌تنهایی و در ترکیب با یکدیگر نشان می‌دهد. جدول شماره 1 و 2 درصد آپوپتوز اولیه، آپوپتوز ثانویه، نکروز و سلول‌های زنده را در سلول‌های تیمار شده با داروهای تنها و نانوذرات حاوی دارو به‌صورت تکی و ترکیبی نشان داده است. نمودار 4 میزان نکروز، آپوپتوز اولیه و ثانویه گروه‌های مختلف تیماری را با یکدیگر مقایسه می‌کند. نمودار 2: نمودار فلوسایتومتریک (هیستوگرام) آپوپتوز 48 ساعته سلول‌های 4T1 مجاور شده با داروها به‌تنهایی و ترکیبی در مقایسه با سلول‌های کنترل. الف: کنترل ب) اورولیموس ج) 5-فلورواوراسیل د) لیتیوم کلرید هـ) ترکیب اورولیموس و 5-فلورواوراسیل و) ترکیب اورولیموس و لیتیوم کلرید ز) ترکیب 5-فلورواوراسیل و لیتیوم کلرید ح) ترکیب اورولیموس، 5-فلورواوراسیل و لیتیوم کلرید. نمودار 3: نمودار فلوسایتومتریک (هیستوگرام) آپوپتوز 48 ساعته سلول‌های 4T1 مجاور شده با نانوذرات حاوی داروها به‌تنهایی و ترکیبی در مقایسه با سلول‌های کنترل. الف: کنترل ب) نانوذرات حاوی اورولیموس ج) نانوذرات حاوی 5-فلورواوراسیل د) نانوذرات حاوی لیتیوم کلرید هـ) ترکیب نانوذرات حاوی اورولیموس و نانوذرات حاوی 5-فلورواوراسیل و) ترکیب نانوذرات حاوی اورولیموس و نانوذرات حاوی لیتیوم کلرید ز) ترکیب نانوذرات حاوی 5-فلورواوراسیل و نانوذرات حاوی لیتیوم کلرید ح) ترکیب نانوذرات حاوی اورولیموس، نانوذرات حاوی 5-فلورواوراسیل و نانوذرات حاوی لیتیوم کلرید. |وضعیت سلولی (%) |آپوپتوز ثانویه |آپوپتوز اولیه |نکروز |سالم |

فایل های پژوهش